动物细胞融合

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,1957年，日本科学家岗田善雄在培养动物细胞时加入失去活性的,仙台病毒,，发现了细胞融合,(rngh),、产生具有两个核的细胞。后来人们用此方法又成功地诱导了不同种动物的体细胞融合,(rngh),，并且能将杂种细胞培养成活，动物细胞融合,(rngh),技术随之诞生。现在这项技术已经广泛应用于细胞学、遗传学、免疫学、病毒学等多种学科的研究工作中。,第一页，共三十七页。,细胞,(xbo),A,细胞,(xbo),B,杂种,(zzhng),细胞,灭活的病毒,物理法,化学法,仙台病毒,疱疹病毒,新城鸡瘟病毒,概念：,通过诱导两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（cell fusion）。如果2个不同的细胞进行融合，则称为细胞杂交（cell hybridization）,第二页，共三十七页。,融合,(rngh),细胞的类型：,同核体（homokaryon）,：由同一生物个体的细胞（基因型相同）所融合形成的融合细胞。,异核体（heterokaryon）：,来自不同基因型的细胞所融合形成的杂交细胞。,第三页，共三十七页。,1.生物方法（病毒,(bngd),）,病毒是最早采用的融合剂。某些病毒被膜中有融合蛋白,（fusion protein），,可介导病毒同宿主细胞融合，也可介导细胞与细胞的融合。,常用于诱导动物细胞融合的病毒有仙台病毒、新城鸡瘟病毒、疱疹病毒等。用作融合剂的病毒必须事先,灭活,（紫外线或-丙内酯），使病毒的感染活性丧失而保留病毒的融合活性。,第二节 诱导,(yudo),细胞融合的方法,第四页，共三十七页。,用灭活的病毒诱导,(yudo),的动物细胞融合过程示意图,第五页，共三十七页。,仙台病毒是最常用的病毒诱导融合剂。,优点：,融合率较高、应用广（对各种动物细胞都适宜）、容易培养（可在鸡胚中大量繁殖）。,病毒介导融合的缺点：,不稳定，在保存,(bocn),过程中融合活性会降低；制备过程比较烦琐。此外，病毒引进细胞后，可能会对细胞的生命活动产生干扰。,第六页，共三十七页。,2.化学诱导融合,化学融合剂主要有高级脂肪酸衍生物、脂质体、钙离子、水溶性高分子化合物、水溶性蛋白质和多肽，,其中最常用的是聚乙二醇（PEG）。,PEG可以促使细胞,(xbo),凝结、破坏互相接触处的细胞,(xbo),膜的磷脂双分子层，从而使相互接触的细胞,(xbo),膜之间发生融合，进而细胞,(xbo),质沟通，形成一个大的双核或多核融合细胞,(xbo),。,第七页，共三十七页。,影响PEG诱导融合效果的因素：,分子量与浓度：分子大、浓度高的PEG，有利于融合，但毒性,(d xn),也随之增大。一般用分子量PEG 1000-4000，40%-60%,诱导时间：长，效率高，但毒性增大、容易形成多核细胞,温度：38-40度,第八页，共三十七页。,3.物理方法(离心，震动，电融合),最常用的是电融合法,细胞在电场中排列成串、聚集成串珠状，然后施加,(shji),高压电脉冲，促使细胞在相互接触的细胞膜处产生穿孔，导致细胞之间的细胞质连通，进而发生细胞融合。,细胞电融合技术有许多优点，如,诱导细胞融合的频率高，对细胞无毒害作用，操作简便，可重复性好。,第九页，共三十七页。,两种亲本细胞融合的混合物中可能有多种类型细胞，如：,1)亲本细胞 2)同核体：同源细胞的融合体 3)异核体：非同源的细胞的融合体 4)多核体：含有双亲不同比例核物质的融合体,筛选的目的是为了,(wi le),获得优良的杂种细胞,第三节 杂种细胞,(xbo),的筛选,第十页，共三十七页。,融合,(rngh),细胞的筛选,方,方法,1.利用,细,细胞形态、,大,大小、颜色,(yns,),差异筛选,2.利用,抗,抗药性筛选,亲本A：,对氨苄青霉,素,素敏感，对,卡,卡那霉素不,敏,敏感,亲本B：,对卡那霉素,敏,敏感，对氨,苄,苄青霉素不,敏,敏感,杂种细胞可,以,以在含有两,种,种抗生素的,培,培养基上生,长,长,第十一页，,共,共三十七页,。,。,3.利用,营,营养互补筛,选,选：,细胞在缺乏,一,一种或几种,营,营养成分时,，,，不能生长,繁,繁殖，即营,养,养缺陷型细,胞,胞。利用两,种,种亲本细胞,营,营养互补作,用,用原理,(yunl),可以筛选杂,种,种细胞。,亲本A：色氨酸缺陷,型,型,亲本B：,苏氨酸缺陷,型,型,杂,杂种细胞可,以,以在不含色,氨,氨酸和苏氨,酸,酸的培养基,上,上培养，而,亲,亲本细胞均,会,会死亡。,第十二页，,共,共三十七页,。,。,4.利用,基,基因缺陷互,补,补筛选,最常用的是,在,在亲本细胞,的,的嘧啶和嘌,呤,呤代谢途径,中,中引入,缺陷突变,来筛选杂交,(zji,o),细胞，即HAT筛选系,统,统。,细胞合成核,苷,苷酸有2条,途,途径：从头,合,合成途径和,补,补救途径。,阻断从头合,成,成核苷酸,途径的物质,(wzh,),：,次黄嘌呤(hypoxantin,，,，H)、氨,基,基蝶呤(aminopterin,，,，A)和胸,腺,腺嘧啶脱氧,核,核苷(thymidin，T)。,HAT培养,基,基：,含有H、A,、,、T的培养,基,基,第十三页，,共,共三十七页,。,。,在HAT培,养,养基上，细,胞,胞从头合成,核苷酸,途径被阻断,(z dun),，只能利用,补,补救合成途,径,径。,在补救途径,中,中，次黄嘌,呤,呤鸟嘌呤磷,酸,酸核糖转移,酶,酶（,简称HGPRT,）和胸苷酸,激,激酶,（TK）,起重要作用,。,。,HGPRT,-,和TK,-,的细胞不能,增,增殖，,但,HGPRT,-,-TK,+,与HGPRT,+,-TK,-,融合细胞,则可以增殖,。,。,第十四页，,共,共三十七页,。,。,鼠,人,X,TK-,HGPRT+,TK+,HGPRT-,鼠,人,鼠,人,鼠,人,TK,+,和HGPRT,+,HAT,HAT,HAT,不分裂,(fnli),不分裂,(fnli),分裂,(fnli),HAT筛选,示,示意图,第十五页，,共,共三十七页,。,。,第四节,融,融合细胞的,克,克隆,(k l,n),化培养,筛选出来的,融,融合细胞仍,属,属于异质性,的,的细胞群，,不,不完全是纯,系,系，需要进,一,一步纯化、,获,获得同质性,的,的细胞群。,常,常用方法是,克,克隆化培养,。,。,克隆化培养,：,：,培养单个杂,交,交细胞、以,得,得到遗传,(ychun),特征相同而,稳,稳定的杂种,细,细胞系。,第十六页，,共,共三十七页,。,。,半固体培养,法,法=平板培,养,养,单细胞在软,琼,琼脂（或者,琼,琼脂糖）培,养,养基上增殖,后,后不能移动,，,，形成集落,。,。待细胞集,落,落长到肉眼,可,可见后，用,吸,吸管从琼脂,上,上挑出来(,一,一般8-10天后,(tinhu),)，再移到,液,液体培养基,中,中，进行繁,殖,殖。,第十,七,七页,，,，共,三,三十,七,七页,。,。,2.,有,有,限,限稀,释,释法,将细,胞,胞稀,释,释到100个/ml，,理,理论,上,上每0.01ml(10,l,)含,有,有,(h,ny,u),1个,细,细胞,。,。取0.01ml,细,细胞,液,液在,培,培养,板,板(,如,如96孔,板,板),的,的小,孔,孔中,培,培养,，,，则,可,可获,得,得单,个,个细,胞,胞形,成,成的,集,集落,。,。,1),取,取1.0ml5,10,4,/ml细,胞,胞+4ml培,养,养基,稀,稀释,，,，得1,10,4,/ml.2),取,取0.5ml1,10,4,/ml细,胞,胞液+4.5ml,培,培养,基,基稀,释,释，,得,得110,3,/ml.3),取,取0.5ml110,3,/ml细,胞,胞液+4.5ml,培,培养,基,基稀,释,释，,得,得100cells/ml.,4),取,取0.01ml,的,的100cells/ml,细,细胞,液,液于,培,培养,板,板小,孔,孔，,加,加0.1ml培,养,养基,，,，培,养,养后,得,得杂,种,种细,胞,胞系,。,。,第十,八,八页,，,，共,三,三十,七,七页,。,。,3.,显,显,微,微镜,操,操作,法,法,通过,显,显微,操,操作,分,分离,杂,杂交,单,单细,胞,胞、,分,分别,单,单独,培,培养,。,。,4.,盖,盖,片,片分,离,离法,1),用,用,钉,钉锤,(d,ngchu,),于洁,净,净的,橡,橡胶,上,上砸,干,干净,盖,盖玻,片,片；2),选,选择,碎,碎块,、,、大,小,小形,态,态适,用,用碎,片,片；3),加,加培,养,养液,、,、进,行,行细,胞,胞培,养,养；4),倒,倒置,镜,镜下,选,选细,胞,胞，,挑,挑出,单,单细,胞,胞玻,片,片；5),进,进行,单,单个,细,细胞,培,培养,。,。,第十,九,九页,，,，共,三,三十,七,七页,。,。,5.,荧,荧,光,光激,活,活分,离,离法,用一,种,种荧,光,光激,活,活细,胞,胞分,类,类器,（,（FluorescenceActivatedCellSorter，FACS,）,）分,离,离杂,交,交细,胞,胞。,原理,：,：将,细,细胞,经,经荧,光,光抗,体,体染,色,色后,，,，经,喷,喷嘴,形,形成,单,单个,细,细胞,的,的线,形,形液,滴,滴，,在,在激,发,发,(j,f,),光的,激,激发,(j,f,),下，,荧,荧光,素,素发,射,射荧,光,光，,此,此信,号,号由,光,光电,倍,倍增,管,管接,收,收，,再,再结,合,合细,胞,胞形,态,态大,小,小产,生,生光,散,散射,信,信号,，,，经,电,电脑,处,处理,，,，产,生,生信,号,号并,与,与预,定,定的,信,信号,对,对比,，,，根,据,据细,胞,胞荧,光,光强,度,度及,细,细胞,大,大小,不,不同,，,，将,细,细胞,分,分成,不,不同,级,级别,，,，在,电,电场,中,中发,生,生偏,离,离，,而,而分,别,别收,集,集于,不,不同,容,容器,中,中。,第,二,二,十,十,页,页,，,，,共,共,三,三,十,十,七,七,页,页,。,。,第,五,五,节,节,细,细,胞,胞,融,融,合,合,技,技,术,术,(j,sh,),的,应,应,用,用,动,物,物,体,体,受,受,抗,抗,原,原,刺,刺,激,激,后,后,可,可,产,产,生,生,抗,体,体,，,抑,抑,制,制,抗,抗,原,原,的,的,作,作,用,用,；,；,增,增,加,加,身,身,体,体,的,的,抗,体,体,就,可,可,以,以,提,提,高,高,机,机,体,体,的,的,抗,抗,病,病,能,能,力,力,。,。,抗,体,体,具,具,有,有,特,特,异,异,性,性,，,，,其,其,特,特,异,异,性,性,取,取,决,决,于,于,抗,抗,原,原,分,分,子,子,的,的,决,决,定,定,簇,簇,。,。,抗,原,原,决,决,定,定,簇,簇,：,：,存,在,在,于,于,抗,抗,原,原,分,分,子,子,中,中,决,决,定,定,抗,抗,原,原,特,特,异,异,性,性,的,的,特,特,殊,殊,化,化,学,学,(hu,xu,),基,团,团,，,，,一,一,般,般,由,由5,8,个,个,氨,氨,基,基,酸,酸,或,或,单,单,糖,糖,或,或,核,核,苷,苷,酸,酸,残,残,基,基,组,组,成,成,。,。,一,、,、B,淋,淋,巴,巴,细,细,胞,胞,杂,杂,交,交,瘤,瘤,生,生,产,产,(sh,ngch,n),单,克,克,隆,隆,抗,抗,体,体,第,二,二,十,十,一,一,页,页,，,，,共,共,三,三,十,十,七,七,页,页,。,。,各,种