RT-PCR检测血细胞中p53基因的表达

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,血细胞P53基因表达检测,RT-PCR,湘雅医检1501,P53,基因,P53,基因,命名,该基因编码一种分子量为,53kDa,的蛋白质,功能作用,重要的抑癌基因，防止癌变,细胞基因的修复功能,RT-PCR,RT-PCR(,反转录,PCR,技术,),RNA,的反转录（,reverse transcription,）,和,cDNA,的聚合酶链式扩增（,PCR,）,相结合的技术。,在,GenBank,中查找,p53,基因,设计引物确定参数,检测,p53,基因在血细胞中的表达,反转录的引物,五个主要问题,基因表达的检测方法,Ques,在蛋白质水平,基因检测的方法,在,DNA,水平,在,MRNA,水平,Northern,印记杂交,RT-PCR,.,Reverse Transcription PCR,RNA,提取,cDNA,反转录,PCR,Northern,印记杂交,Northern,印记杂交,基因表达水平,随机六核苷酸引物引导,Oligo(dT),引导,特异性引导,Ques,反转录酶,逆转录酶（,reverse transcriptase,）是存在于,RNA,病毒体内的依赖,RNA,的,DNA,聚合酶，至少具有以下三种活性,：,(1),依赖,RNA,的,DNA,聚合酶活性,：以,RNA,为模板合成,cDNA,第一条链；,(,2)Rnase,水解活性,：水解,RNA:DNA,杂合体中的,RNA,；,(3),依赖,DNA,的,DNA,聚合酶活性,：以第一条,DNA,链为模板合成互补 的双链,cDNA.,反转录可用的引物,01,03,05,Oligo(dT),：是一种对,mRNA,特异的方法。因绝大多数真核细胞,mRNA,具有,3,端,Poly(A),尾，此引物与其配对，仅,mRNA,可被转录。,随机六聚体引物,：用此种方法时，体系中所有,RNA,分子全部充当了,cDNA,第一链模板，,PCR,引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的,cDNA,中,96%,来源于,rRNA,。,特异性引物,：用含目标,RNA,的互补序列的寡核苷酸作为引物，用此类引物仅产生所需要的,cDNA,，导致更为特异的,PCR,扩增。,Ques,查找,P53,序列,使用,GENBANK,，,P53,登陆号,AH007667,http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank,查找,P53,序列,查找,P53,序列,查找,P53,序列,引物设计的原则,1,5,2,6,3,7,4,8,引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性,产物不能形成二级结构,引物长度一般在1530碱基之间,G+C含量在40%60%之间,碱基要随机分布,引物自身及之间不能有连续4个碱基的互补,引物5端可以修饰,引物,3,端不可修饰,引物3端要避开密码子的第3位,Ques,引物设计,PRIMER PREMIER 5.0,PrimerPremier5.0,是由加拿大的,Premier,公司开发的专业用于,PCR,或测序引物以及杂交探针的设计、评估的软件，其主要界面分为序列编辑窗口（,Genetank,），引物设计窗口（,PrimerDesign,），酶切分析窗口（,RestrictionSites,）和纹基分析窗口（,Motif,），这里我们主要介绍其引物设计功能。,引物设计,1,启动界面,引物设计,2,在此输入需扩增的,DNA,序列,引物设计,3,引物设计,4,引物设计,5,引物设计,6,引物设计,7,引物设计,8,Hairpin,：发夹结构,Dimer,：二聚体,False Priming,：错配,Cross Dimer,：交叉二聚体,引物设计,9,引物设计,10,引物设计,11,保存,选择满意的引物,引物设计,12,所选引物,确定参数,cDNA size:434bp,94,度,30,秒,变性,1,55,度,45,秒,退火,2,73,度,60,秒,延伸,3,27,次,循环,4,确定参数,四项参数,循环次数,退火,延伸,变性,模板,DNA,由双链变成单链，有利于与引物结合。可根据模板的复杂程度调整变性温度和时间，一般情况下,94,C 30,秒可使各种复杂的,DNA,分子完全变性,。,变性的,DNA,快速冷却至,40,60,C,可使引物和模板,DNA,发生结合。可根据引物的长度和,G,C,的含量选择复性温度,一般是,70,75,C,，此时,Taq DNA,聚合酶活性最高。,1kb,的可适当延长时间。,理论上,20,25,个循环,PCR,产物的累计即可达到最大值、实际操作中,25,30,较合理。,确定参数,退火温度：,50,54,Ques,检测基因的表达,根据产物长度制作适宜浓度的琼脂糖凝胶，取适量,PCR,产物，加上样缓冲液充分混合，点样于事先做好的琼脂糖凝胶点样孔中，,10V/cm,电泳,45,60min,。成像系统成像分析。,琼脂糖凝胶电泳分离产物,：,检测基因的表达,1 2 3 4,Marker,（,DNA,分子量标准）,cDNA,假阳性对照（出现的,PCR,扩增条带一致，有时更整齐更明亮）,假阴性对照（什么条带没有）,谢谢,汇报人：李尽美,日期：,2016-11-21,