植物组织培养-外植体的选择与建立

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第三节 外植体（培养物）的建立,1、主要任务,：,成功的将外植体建立在试管中。,2、主要技术环节,：,（1）、外植体的选择,（2）、外植体的消毒,（3）、培养基的选择、配制,（4）、外植体消毒与接种,3、关键问题,：,（1）、污染（Infection）,（2）、褐变（Browning）,第二节 外植体（培养物）的选择,根据细胞全能性学说，植物体的每一个细胞都含有全部的遗传信息，都能再生出一个新植株。但是，要使每个细胞的全能性都表现出来，在目前还是不易做到的事。因而，外植体（初始培养物）的选择非常重要。,1、基因型：,再生能力,（1）、双子叶单子叶；,（2）、被子植物裸子植物；,（3）、双子叶植物中：茄科（,Solanacea,）；秋海棠科（,Begoniaceae,）；景天科（,Crassulaceae,）；苦苣苔科（,Gesneriaceae,）；十字花科（,Cruciferae,）再生力特强；郁金香（,Tulip,）再生力较弱。,（4）、同一种植物中：活体（,in vivo,）再生力强者，离体（,in vitro,）再生力也强。,第二节 外植体（培养物）的选择,杜鹃花,Rhodoendron,第二节 外植体（培养物）的选择,2、根据母株的年龄和生长发育阶段选择：,生长,开花,童年期,转变年期,成年期,年 龄,阶段发育,第二节 外植体（培养物）的选择,2、根据母株的年龄和生长发育阶段选择：,植株的生长与发育,第二节 外植体（培养物）的选择,2、根据母株的年龄和生长发育阶段选择：,年龄或幼化程度,外植体建立,母株年龄和幼化程度与外植体建立,阶段发育,外植体建立,母株阶段发育与外植体建立,第二节 外植体（培养物）的选择,杜鹃花 van Weerden Poelman,第二节 外植体（培养物）的选择,第二节 外植体（培养物）的选择,3、根据时间和季节取材,生长物质含量,时间或季节,抑制物质含量,时间或季节,第二节 外植体（培养物）的选择,3、根据时间和季节取材,物质含量,时间或季节,抑制物质,生长物质,取材时间,取材时间,第二节 外植体（培养物）的选择,4、根据母株位置选择：,具原基结构的外植体：茎尖、侧芽、原球茎、鳞芽、分生组织,不具原基结构的外植体：根、茎、叶、花、果等器官，需要脱分化。,第二节 外植体（培养物）的选择,第二节 外植体（培养物）的选择,第二节 外植体（培养物）的选择,第二节 外植体（培养物）的选择,第二节 外植体（培养物）的选择,第二节 外植体（培养物）的选择,4、根据外植体的大小选择：,外植体大小,外植体建立,外植体大小与外植体建立,第二节 外植体（培养物）的选择,4、污染（Infection）,能否有效地控制微生物污染是植物离体培养是否成功的关键技术之一。对于离体培养的探索性研究实验，污染会导致实验失败；对于大规模的离体繁殖生产来说，污染使生产成本大大增加。因此，无论是科研机构还是生产厂家都十分重视微生物污染问题。,植物离体培养中的污染可分为,外植体,、,培养基、无菌操作,和,培养环境,四个方面。其中培养基和无菌操作方面的污染，目前已得到十分有效的控制。外植体方面污染最复杂，也最难控制，其可能是细菌引起的，也可能是真菌引起的；微生物可能是附生性的，也可能是内生性的。近年来，国外较重视各种微生物的鉴定，并根据不同的微生物种类采取相应的控制措施，这方面的研究进展较快。,第三节 外植体（培养物）的建立,（1）、产生污染的因素：,外植体,：通常多年生的木本材料比一二年生的草本材料带菌多；老的材料比幼嫩的带菌多；田间生长的材料比温室的带菌多；带泥土的材料比清洁的带菌多。一年中以雨季的材料带菌多，一天中以中午阳光最强时的材料带菌少。,培养基,：高压蒸汽灭菌的温度、压力、时间和正确使用情况，以及过滤灭菌中过滤膜孔径、过滤灭菌器械的灭菌处理、过滤灭菌操作等均影响培养基的灭菌效果。,操作环节,：接种室是否清洁、干燥、密闭，是否经常用紫外线灯照射、甲醛熏蒸、70酒精喷雾杀菌等，操作是否等熟练。,培养环境,：培养室要求清洁、密闭。每天用70酒精喷雾除菌、降尘，每周用少量甲醛熏蒸灭菌。如有空气过滤装置效果更好。培养室相对湿度太高时，污染加重。,第三节 外植体（培养物）的建立,（2）、污染的防止,：,母株保护,：保持母株清洁，减少喷灌。温室种植，喷施杀菌（虫）剂，减少病原菌含量。,材料选择,：选取生长发育健壮，病虫危害少的材料。,严格清洗,、消毒与无菌操作。,小容器、分散接种,。,第三节 外植体（培养物）的建立,（3）、污染估算及对策：,污染估算：,首次接种通常污染率4060%,按40%计：接种100个材料,1个材料/容器：,污染量=100X40%=40,获得量=100-40=60。,2个材料/容器：,2污染：1X40%X40%=16%,1污染：2X40%X40%=32%,2未污染：60%X60%=36%,污染率=100-36=62%,污染量=100X62%=62,获得量=100-62=48,3 个材料/容器：,污染率=100-（60%）,3,=78.4%,污染量=100X78.4%=79,获得量=100X（60%）,3,=21,4 个材料/容器：,获得量=100X（60%）,4,=13,5 个材料/容器：,获得量=100X（60%）,5,=8,防止污染的对策：,小容器、多数量、尽量分散、相互隔离,弃掉,第三节 外植体（培养物）的建立,（4）、附生菌控制：,采用化学杀菌剂可以有效地杀死附生菌，但是一些较特殊的外植体材料，如密披绒毛的叶片或幼果、花芽或带苞片的叶芽，附生菌可能潜伏在外植体上，无法彻底清除。这时，必须采取一些特殊的措施，才能有效控制附生菌。,取材来源,：,从保护条件下生长的植株上取材，可有效地控制微生物污染。保护条件指温室、培养箱、生长室等。从温室、培养箱里取材，可有效减少附生菌的群体数量。从栽培于温室中的植株上取材和从露地取材相比，前者污染率更低。,所取植株的生长土壤，是组织培养中的一个重要污染源。如果采用温室栽培，事先应进行土壤灭菌。此外，灌溉水也可能成为污染源。取材于用过滤水和用缄市饮用水灌溉的植株，前者大大降低了微生物污染.,材料预处理,：,在对外植体进行常规化学灭菌之前，对特殊材料进行特殊预处理，可以收到很好的效果。例如，在对密披绒毛的枇杷幼果进行灭菌之前，先把绒毛刮去，灭菌效果很好。对于密披绒毛的叶片，可先连枝带叶放在自来水下冲洗，去除污物后，用0.5Tween20浸1h（其间换新鲜液23次），然后进行常规灭菌，就可起到彻底杀菌的作用。对兰花花芽常规灭菌之前，先用10的杀藻铵（Benzalkonium Chloride）溶液浸渍材料10min，效果很好。,第三节 外植体（培养物）的建立,（5）、内源菌防治：,植物组织培养中对材料只能进行表面灭菌，而对材料,组织内部,所带的细菌往往难以对付。,表面污染与内源污染的区别：,第三节 外植体（培养物）的建立,常见内源菌,：芽孢杆菌（rod bacteria）为主，尤其是,Bacilus licheniformis,和,B.subtilis,（“white ghost”）。真菌中主要是镰刀菌,(Fusarium)、,轮枝孢菌,(Verticillium)、,瓶霉菌,(Phialophora),和丝核菌(Rhizoctonia)。,内源菌的检测,：通常情况下，通过观察培养瓶就可看到一些污染的迹象；但是对于生长缓慢的细菌或内生菌来说，仅靠肉眼观察是不够的，必须通过指示培养，即采用微生物特别容易生长的培养基和培养条件，让外植体上的微生物快速生长，然后予以鉴定培养基中加入蛋白胨（peptone）、胰蛋白胨（trypone）或酵母汁(YE)。,第三节 外植体（培养物）的建立,第三节 外植体（培养物）的建立,防止方法：,在培养基中加入抗生素。,利用茎尖培养。,利用无菌材料。,抗生素防治内源菌：,外植体顶芽培养发现的污染、不同采收期外植体存在的污染和表面彻底消毒后的细菌污染都可能是内生菌造成的。内生菌的污染，无论用何种表面消毒方法都不能彻底消除，因此，,必须使用抗生素进行间接防治处理,。,选用适当的抗生素特别重要。理想的抗生素应该具备以下特性：可溶性、稳定性、不受pH高低和培养基差异的影响、无边界效应、广谱性、杀菌性、不产生抗性诱导、既廉价又对人体无害。,第三节 外植体（培养物）的建立,常用如下抗生素：,链霉素(10 mgL)、青霉素(20mgL)、地霉素(5mgL)、夹竹桃霉素(20mgL)、杆菌肽(50mgL)、新霉素(1mgL)。,例如：用奥复星（氧氟沙星注射液）4080 mgL、注射用的青霉素96192 mgL可有效抑制枣树试管苗的细菌污染，而链霉素40800mgL和硫酸庆大霉素2060mgL抑制枣树细菌效果不明显。,第三节 外植体（培养物）的建立,单独使用一种抗生素，通常效果很差，几种抗生素的配合使用，可以起到协同增益作用，但有时也可能使个别药物相互作用而失效。几种高浓度杀菌剂配合使用很可能对植物有毒害。,对于某一特定细菌，确定抗生素的最低杀菌剂量是很重要的，这种最低剂量可以通过不同浓度的抗生素与细菌进行液体共同培养来确定。若找到有效浓度，则在实验处理前就可确定对植物材料的毒性范围。,第三节 外植体（培养物）的建立,抗生素对植物材料的毒性因植物类型不同差异很大，因此，用植物离体培养进行基本的测试是实验成功的重要一步。由于植物毒性影响或抗生素渗透性差，在处理污染实验中，抗生素对分离组织也可能失效。了解抗生素对细菌和植物二者的效应，是消除污染和保护培养物的关键。,此外，抗生素常作为预防污染作用而加入到培养基中，或者在已鉴定出细菌污染的情况下，用于抑制细菌生长或消灭细菌。抗生素的抗菌作用在中性培养基(pH6.57.5)中比常规状态提高许多，而在酸性条件下则失效，而且抗生素具有热敏感性，不能采用高温高压灭菌，只能采用过滤灭菌的方法加入培养基。,第三节 外植体（培养物）的建立,（6）、特殊污染源：,污染中,特别注意,一种呈乳白色的细菌污染，这种细菌为芽孢杆菌。法国林木育种协会鉴定为,迟缓芽孢杆菌,(,Bacilluslenlus,)，它外被荚膜，耐高温，一般灭菌剂难以杀死。它可以随培养材料、用具等传播；它可出现在培养基表面，或呈滴形云雾状存在于培养基内。,若出现应及时淘汰污染源，并对所用过的器皿和用具进行严格高温灭菌处理。,第三节 外植体（培养物）的建立,5、褐变（Browning）：,（1）、概念：,外植体在培养容器中被氧化变褐而死亡的现象。,第三节 外植体（培养物）的建立,（2）、外植体材料褐化原理：,植物组织的褐化是通过,含铜的氧化酶,如多酚氧化酶和酪氨酸酶起作用所致，其作用的底物通常是酪氨酸和邻位羟酚类化合物如绿原酸等。酶和底物在植物正常生长的情况下是在组织内的不同部位，当细胞受伤或组织垂死时，酶和底物就跑到一起发生作用，当酚被氧化为活性酸化物和环形多聚体氧化蛋白时便形成深色化合物，这些物质又很快被氧化和变成复杂的抑制性物质，从而导致外植体材料变褐死亡并使培养基变褐。,第三节 外植体（培养物）的建立,（3）、褐化发生的可能因素：,与组培植物品种有关：,不同的植物种与品种之间常有很大差异，有人把此归结为基因型的不同。一般来说，植物材料中单宁类和多种羟酚类化合物的含量高，易引起外植体材料的严重褐化。多数木本植物比草本植物易引起褐化，多年生草本植物比一年生草本植物易引起褐化。,第三节 外植体（培养物）的建立,第三节 外植体（培养物）的建立,与取样外植体年龄有关：,引起褐化程度的轻重常与取样外植体组织的年龄有关，通常是幼龄部位产生褐化较轻，随着组织的老龄化而褐化加重。因此，在外植体接种时常需要剥去鳞片和大叶片，尤其是以切取幼嫩的芽尖或切取顶芽分生组织（或带少量叶原基）接种更为理想。,与外植体取样时间有关：,外植体材料的褐化程度常与外植体的取样时间有关。一般在春夏季，尤其是春季采取