基因功能的研究方法

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第十章.,基因功能的研究方法（一）,一、计算机预测基因功能,二、实验确认基因功能,1,基因失活,是功能分析的主要手段,1.1,基因敲除,（Gene knock-out）,1.2,基因敲除的技术路线,1.3 基因敲除的主要应用领域及国内外研究进展,1.4 基因失活的表型效应有时不易分辨,2,转座子突变库的构建,2.1 插入序列,2.2 实验步骤,3,内含子归巢突变,4,基因的超表达,用于功能检测,5.,反义RNA,5.1 反义RNA的分类和作用机制,5.2 ticRNA,(transcription inhibitory complementary RNA),5.3 反义RNA的功能,5.3.1 调控细菌基因的表达,5.3.2 噬菌体溶菌/溶源状态的控制,IS10转位作用的抑制,5.4 人工合成构建反义RNA,5.5 使反义RNA分子稳定的方法,三、其他的基因功能研究方法,噬菌体,展示(phage display),酵母双杂交,(yeast two-hybridization),2.1 概念,2.2 实验步骤,2.3 利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能,2.4 利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用,2.5 利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响,2.6 利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图(Genome Protein Linkage Map）,3.,开放读框顺序标签,(open-reading-frame sequence tags,OSTs）,确认,DNA顺序,中的,基因序列,后，下一个问题就是,探知其功能,，这是基因组研究的一个难度很大的领域。,一些已完成测序的基因组顺序分析表明，我们所,了解的,基因组内容,比真实的情况少的多,。如大肠杆菌与啤酒酵母，在未开始基因组测序前已经完成了,大量常规的遗传学分析,，当时遗传学家认为,这2种生物的大多数基因,已经通过,突变鉴定,，但实际上还有很多空白。,大肠杆菌编码蛋白质的4288个基因中，以往知道的只有1853个，仅占,43%,。至于啤酒酵母，所知更少，仅为,30%,。,一、计算机预测基因功能,计算机预测基因功能的依据仍然是,同源性比较,。同源基因都有,1个,共同的祖先基因，他们之间有许多,相似的顺序,。同源基因可以分为2类：,种,间,同源基因,或,直系基因,(,orthologous gene,)这是指不同物种之间的同源基因，它们来自物种分隔之前的同一祖先。,种,内,同源基因,或,平行基因,(,paralogous gene,)同一种生物内部的同源基因，它们常常是,多基因家族的不同成员,，其共同的祖先基因可能存在于物种形成之后，也可能出现于物种形成之前。,同源基因,一般不会有完全一致的核苷酸顺序，因为这两个基因在出现后,独立的发生随机突变,，但它们有,相似的顺序组成,，大部分,未,突变的核苷酸位置,是相同的。,当一个,新的基因序列被确认,后，根据同源性可从数据库中,查找已知顺序的同源基因,。根据,进化的相关性,可从,已知的同源基因,推测新基因的功能。,根据同源性预测基因时必需注意以下几点,：,一般认为,aa,的一致性,或,相似性,在,25%,以上,可视为同源基因；,同源性,与,相似性,的含义不同，如,aa,顺序的,80%,的相似性不能称为同源性。,一致性,常指,同一位置同一,aa,在整个多肽序列中所占的比例,，而,相似性,除一致性,aa,外,还包括可取代,aa,的成员,，因此,相似性,aa,的比例总是高于一致性,aa,。,同源性分析可以给出整个基因或某一区段功能的信息,同源查询,除了直接比较DNA顺序外，还可将DNA顺序,翻译为aa顺序,。由于组成蛋白质的aa有20多种，而DNA核苷酸只有4种，因此,aa顺序的差异,要比,核苷酸的差异,大的多,。,以,aa顺序,进行同源性比较,的结果,更为准确,，也,更加可行,。已有许多软件可用于这项分析，常用的是,BLAST,。研究者只要将资料以,正确格式的电子邮件,发送到DNA资料库BLAST服务站，很快就会得到回音。,有时在2个,无明显亲缘关系的基因之间,会出现,局部相似的区段,。这种情况表明，,2个无亲缘关系的蛋白质可能具有相似的功能,，相似的顺序是,功能的核心区域,。,虽然,基因本身,无共同的祖先，但,其功能域,却有共同的起源,。它们都是古老祖先的后裔，在进化中,一方面发生,独立突变,，另一方面又因,基因组重排,成为新基因的组成部分。例如信号传导蛋白，这类蛋白质一般都有,2个基本的功能域,，即,接受,信号的功能域,和,传达,信号的激酶域,。,二、实验确认基因功能,同源性分析并非万灵药方，对许多,新基因的功能分析,还必需,依赖其他的实验手段,进行补充，并将同源性研究的结果进一步,外延,。,如何,确定一个基因的功能,是,基因组计划,中最困难的问题之一。,大多数分子生物学家认为,现有的技术与策略,对于从基因组测序所获得的大量,未知基因,的,功能研究,是远远不够的。,基因的功能是一个过程，是从,基因到表型,的一系列反应。,传统的遗传分析,是,从表型出发,最终到达,基因,；,现在的基因功能研究,是,从基因出发,直接推导,表型,。因此必须寻找一系列的实验方法来,鉴别与目标基因相关的,表型,。,1基因失活是功能分析的主要手段,传统的遗传分析主要借助,突变型,研究,表型变异的遗传基础,，利用,紫外线诱导,及,化学试剂,处理可使生物群体产生突变个体，也可从,自然的群体中发现,突变体。,经遗传分析,将突变基因定位,，然后观察,这一突变体是否与改变的表型对应,。在此基础上采用分子生物学方法进一步,分离与克隆目标基因。,所谓,定位克隆,就是根据,与突变位点,连锁,的,分子标记,，然后,通过物理图,寻找,靶位点,。,上述传统遗传学分析的原理同样可用来设计,从基因到表型的研究,。如果我们能找到某种方法，根据,待测基因的顺序,使生物体内,该基因失活,，亦可鉴别由此产生的,表型变异,。,1.1,基因敲除,（Gene knock-out）,概念：基因敲除除可,中止某一基因的表达,外，还包括,引入新基因,及,引入定点突变,。,即可以是用,突变基因,或,其它基因,敲除相应的正常基因,，也可以用,正常基因,敲除,相应的突变基因,。,基因敲除是80年代后半期应用,DNA同源重组原理,发展起来的一门新技术。80年代初，,胚胎干细胞,（,ES细胞,）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。,1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。,到1987年，Thompsson首次建立了,完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型,。此后的几年中，基因敲除技术得到了进一步的发展和完善。,1.2,基因敲除的技术路线,如下：,构建,重组基因载体,；,用电穿孔、显微注射等方法把重组,DNA,转入受体细胞核内,；,用选择培养基,筛选,已击中的细胞；,将击中细胞转入胚胎使其生长成为转基因动物，对转基因动物进行,形态观察,及,分子生物学检测,。,Note:,基因敲除的靶细胞目前最常用的是,小鼠ES细胞,。基因敲除的技术路线虽不复杂，但由于高等真核细胞内,外源DNA,与,靶细胞DNA序列,自然发生,同源重组,的机率非常低，约为,百万分之一,，要把基因敲除成功的细胞筛选出来是一件非常困难的工作。因此，,同源重组的筛选和检测,就成了基因敲除技术所要解决的,关键问题,。,目前已有,多种筛选方法,，其中1988年犹它大学的Capecchi教授的研究组发展的,正负双向选择系统,适用范围宽且效率较高。,1.3 基因敲除主要应用领域及国内外研究进展,基因敲除的,应用领域,主要有：,建立人类疾病的,转基因动物模型,，为医学研究提供材料；,改造动物基因型,，鉴定新基因和,/,或其新功能；,治疗,遗传病；,改造生物、培育,新的生物品种,。,ES细胞基因敲除途径,建立转基因小鼠技术的成熟，首次使,体外精细的基因操作,与小鼠的整个,生长发育,和,生命过程,得到了直接的,结合,，为探讨高等动物,基因组结构和功能,提供了有效的方法。,由基因敲除技术产生出的特殊小鼠已经对哺乳类生物学的各领域，包括发育生物学、癌生物学、免疫学、神经生物学和人类遗传学产生了极大影响。,理论上，基因敲除可适用于,任何能产生ES细胞的物种,，将来可在小鼠基因敲除成熟的基础上开展,其它实验动物的基因敲除,工作。,建立人类疾病的,转基因动物模型,，为医学研究提供材料,基因敲除小鼠是研究,疾病的发生机理,、,分子基础,及,诊断治疗,的重要实验材料。如,1989,年,囊性纤维化病,（,CF,）的致病基因（,CFTR,）被成功地克隆；,1992,年成功建立了,CFTR,基因,的基因敲除的,CF,小鼠模型,，为,CF,基因治疗提供了很好的动物模型，得以顺利通过了,基因治疗,的,动物试验,；于,1993,年开始,临床试验,并获得成功。,改造动物基因型，鉴定新基因和,/,或其新功能，研究发育生物学,深入研究基因敲除小鼠在胚胎发育及生命各期的表现，可以得到详细的有关该基因在生长发育中的作用，为研究,基因的功能,和,生物效应,提供模式。,例如，目前,人类基因组研究,多由,新基因序列的筛选检测,入手，进而用基因敲除法在小鼠上观察该,基因缺失,引起的表型变化。目前已报道了多种学习、记忆以及,LTP,、,LTD,有缺陷的基因敲除动物,，发现多种基因在学习、记忆的形成过程中必不可少,。,治疗遗传病,这包括,去除,多余基因,或,修饰,改造,原有异常基因,以达到治疗的目的。,改造生物、培育新的生物品种,细菌的基因工程技术是本世纪分子生物学史上的一个重大突破，而,基因敲除技术,则可能是遗传工程中的另一重大,飞跃,。这项新技术在基础理论研究及实际应用中都将有着广阔的应用前景。,1.4 基因失活的表型效应有时不易分辨,通过上述种种方法得到的,携带失活基因,的品系与个体后，下一步工作就是,检测突变体表型,以便,指认,未知基因,的,具体功能,。这一步也会遇到难题，,生物表型范畴很广,。,即使单细胞的,酵母,，要确认,一个未知基因对表型的贡献,，也可列出很长的一串名单。,至于高等生物，因其,某些表型,具有,难以捉摸的综合性,，区分其,准确的功能,更加棘手。,2转座子突变库构建,转座子标签法又称,基因标签,(gene tagging)，通过,构建插入突变库系统,，,分离与克隆,功能基因与调控顺序,。这一策略主要依据以下技术：,植物,体细胞全能性,；,已经建立了一套成熟的,转基因系统,，使外源基因在转基因植株中成功表达。,植物中有许多转座子系统，它们的转座机制已经清楚，通过,转座子的随机插入,可获得,大量的突变型,，根据插入的,转座子序列,合成探针，可,分离被破坏的位点,，并分析它们的组成。,转座子可以发生,回复突变,，从插入的座位脱离，使突变系重现,野生型表型,。,目前应用的最成功的是玉米的,Ac-Ds转座因子,系统。基因标签,突变库,的工作原理如下：,玉米色粒调控元件,Ac-Ds 系统：第9 染色体 C 基因：色素合成基因。,Ac,基因：,自主,移动的调节因子，4.5 kb，5 个exon，编码,转座酶,。Ds 基因：,非自主,移动的受体因子，0.54.0 kb，,与Ac 有同源序列,，插入引起色素不能合成。,2.1 插入序列,(insertion sequence,IS),仅含有,转座酶基因,的简单转移序列。长度多在7001500bp左右。由,末端反向重复序列,(IR)，转座酶基因组成。插入基因组中时，在靶位上生成,正向重复序列,(,DR,)常见的IS结构。,IS 长度 末端IR 靶位DR 插入选择IS1 768 23 9 随机IS2 1327 41 95 热点IS4 1428 18 （12）AAAN20TTTIS5 1195 16 4 热点IS10 1329 22 9 TNAGCN IS50 1531 9 9 热点,2