血栓与止血检验进展课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,上海第二医科大学附属瑞金医院,上海血液学研究所,王鸿利,血栓与止血检验进展,近年，随着基础理论和实验技术的不断发展，血栓与止血的检验方法及其临床应用也有很大的进展，下面就近年来血栓与止血检验的进展作一简述。,（一）血小板微颗粒检测,血小板被激活后，它以出芽方式形成囊泡或以伪足断裂方式形成血小板颗粒（,platelet micropaticle,PMP,）。,PMP,的体积较正常血小板为小，但有完整的血小板膜结构和功能。,检测血循环中的,PMP,可较完整地反映血小板参与血栓形成和血液凝固的功能。,检测方法：流式细胞术或微颗粒捕获法。,参考值：,58,15/10,4,PLT,（山东大学齐鲁医院）,（一）血小板微颗粒检测,（一）血小板微颗粒检测,临床意义：,PMP,主要反映血小板活化或破坏，用于动脉血栓性疾病的检测，它是动脉血栓形成的敏感和特异的分子标志物。,1.,急性冠脉综合征（,ACS,）,PMP,2.,脑血栓形成,PMP,3.ITP,出血的判断指标,4.PNH,患者,PMP,5.,肿瘤患者,PMP,（二）血小板,-,白细胞聚集体检测,血小板被激活后，血小板释放,P-,选择素（,P-selectin,或,GMP-140,）。,P-,选择素与白细胞和（或）单核细胞膜上的,P-,选择素配体糖蛋白,-1,（,PSLG-1,）结合形成血小板,-,白细胞聚集物和（或）血小板,-,单核细胞聚集物，是反映动脉血栓形成的特异性标志物之一。,检测方法：流式细胞术。,参考值：,15.38.5,（,PLA/L,）瑞典报道,。,临床意义：动物实验和临床研究表明，血小板,-,白细胞聚集物是更敏感和更特异的血栓标志物。,在胸痛患者中，血小板,-,白细胞聚集体水平为,AMI,胸痛组非,AMI,胸痛组正常对照组；分别为,34.210.3,19.31.4,15.38.5,（二）血小板,-,白细胞聚集体检测,（三）血管性血友病因子裂解蛋白酶活性检测,生理情况下，由血管内皮细胞合成的血管性血友病因子（,vonWillebrand factor,，,vWF,）主要受,vWF,裂解蛋白酶（,vWF cleaving proteinase,vWF-CP,）的调节。使,vWF,不能过度地参与血小板的黏附和聚集。因此,vWF-CP,是限制血栓形成的指标之一。,（三）血管性血友病因子裂解蛋白酶活性检测,vWF-CP,为金属蛋白酶,ADAMTS,亚家族中的一个成员（,ADAMTS-13,）,检测方法：,ELISA,法。,参考值：,83,例正常人,（,1,）血浆（,n,30,）,vWF,：,CBA,为,2.1,40.5,（,21.99.2,）,（,2,）血清（,n,53,）,vWF,：,CBA,为,2.4,52.0,（,20.510.8,）,（三）血管性血友病因子裂解蛋白酶活性检测,临床意义：,1.,血栓性血小板减少性紫癜,-,溶血性尿毒症,综合征（,TTP-HUS,）：,vWF-CP,基因缺陷,或存在抗,vWF,CP,自身抗体,故,vWF-CP,使超大,vWF,不能降解，导致血栓形成。,其特异性,97,，敏感性,100,。,2.,血管性血友病（,vWD,）：血浆,vWF-CBA,水平明显低于正常。,3.,恶性肿瘤：,vWF-CP,活性水平显著低于正常,（三）血管性血友病因子裂解蛋白酶活性检测,（四）双相,APTT,（,biphasic APTT,）检测,凝血是一个动态变化的过程，而传统的,APTT,检测只能提供血液凝固时间这一单个的信息。,双相,APTT,检测，是在常规,APTT,检测的基础上，联合利用光度计和分析软件，全程记录血浆凝固前后浊度的变化，并且绘制血液凝固过程中的透光度的波形变化图，可以提供在纤维蛋白聚集体形成之前凝血时间、速率、加速度的变化的多种量化的信息。,（四）双相,APTT,（,biphasic APTT,）检测,检测方法：法国生物梅里埃（,bioMerieux,）公司的,MDA,血凝分析仪。,双相,APTT,透射波形图,(A:,正常,;B:DIC),（四）双相,APTT,（,biphasic APTT,）检测,临床意义：,对诊断,pre-DIC,特别有价值。敏感性为,97.6,，特异性为,98,。,大于,50,的患者在,DIC,前,18h,就出现双相,APTT,的变化。,（五）凝血酶激活的纤溶抑制物检测,凝血酶激活的纤溶抑制物（,thrombin activatable fibrinolysis inhibitor,，,TAFI,）由肝脏合成，经凝血酶,-,凝血酶调节蛋白复合物（,T-TM,）作用后变成活化型的,TAFI,。,TAFI,具有抑制纤溶酶原转化为纤溶酶的生物活性，但是,TAFI,也受蛋白,C,抑制物（,PCI,）的抑制。,（五）凝血酶激活的纤溶抑制物检测,检测方法：,TAFI:Ag ELISA,法,TAFI:A,发色底物法,参考值：（上海瑞金医院）,TAFI:Ag,（,n,34,）为,7728,（,21,133,）；,TAFI:A,（,n,34,）为,245mg/L,（,14,34g/L,）。,（五）凝血酶激活的纤溶抑制物检测,临床意义：,TAFI:Ag,和,TAFI:A,水平升高：见于深静脉血栓（,DVT,）、动脉血栓（冠心病）、微血栓（,DIC,），其他,TAFI,水平升高还见于感染、炎症、,FV Leiden,突变。,TAFI,水平降低：见于某些凝血因子减少（如血友病、,FXI,减低），急性早幼粒细胞白血病（,TAFI:A,减低,66,，,TAFI:Ag,正常）。,（五）凝血酶激活的纤溶抑制物检测,（六）可溶性血管内皮细胞蛋白,C,受体检测,可溶性血管内皮细胞蛋白,C,受体（,soluble endothelial protein C receptor,sEPCR,）是由血管内皮细胞产生，部分与内皮细胞连接称膜连,EPCR,，一部分游离于血浆称,sEPCR,。,血浆中,sEPCR,与膜连的,EPCR,具有相反的作用。,sEPCR,可与,PC,和,APC,结合，抑制,PC,的活化和抑制,APC,的抗凝活性，减轻膜连,EPCR,的增强,PC,活化和,APC,的抗凝作用，所以血浆,sEPCR,水平的增高是反映血管损伤和抗,APC,抗凝作用的特异性标志物。,（六）可溶性血管内皮细胞蛋白,C,受体检测,检测方法：双抗体夹心,ELISA,法。,参考值：,血浆,sEPCR,为,115.220.7g/L,。,临床意义：血浆,sEPCR,水平的增高是反映血管损伤和抗,APC,抗凝作用的特异性标志物。安徽省立医院的结果见下表。,（六）可溶性血管内皮细胞蛋白,C,受体检测,（七）蛋白,C Global,试验,凝血酶（,T,）与血管内皮细胞表面的凝血酶调节蛋白（,TM,）形成复合物（,T-TM,），后者使蛋白,C,（,PC,）形成活化蛋白,C,（,APC,）。,APC,在蛋白,S,（,PS,）的辅助下，灭活因子,Va,和因子,VIIIa,，还抑制纤溶酶原激活抑制物,-1,（,PAI-1,）使纤溶活性增强。此外，,Agkistrodon contorix,蛇毒可以取代,T-TM,复合物直接激活,PC,，使,PC,转化为,APC,，,APC,也受,PCI,的抑制。,（七）蛋白,C Global,试验,检测方法：在待测血浆中加入蛇毒温育，蛇毒可直接激活,PC,转变为,APC,。随后加入,APTT,试剂以检测依赖,PC,活性的血浆凝固时间（,Protein C activity-dependent clotting time,，,PCAT,）。若待测血浆中的,PC,系统正常，则加入,Ca,2+,后血浆凝固时间显著延长。为了避免诸多因素的影响，本试验设计了对照组，即在试验过程中以缓冲液代替,PC,激活剂，血浆不依赖,PC,活性的血浆凝固时间（,PCAT/O,），其结果应短于,60,秒。,（七）蛋白,C Global,试验,参考值：,PCAT,为,85,200,秒，,PCAT/O,为,33,55,秒（,n,234,）,临床意义：,本试验多用于蛋白,C,、蛋白,S,、,FV Leiden,突变和,FII 20210 GA,突变的检测，起到蛋白,C,系统筛选检测作用。,本试验也有假阳性，见于凝血因子,V,、,VIII,活性升高、口服抗凝剂和狼疮抗凝物等。,（七）蛋白,C Global,试验,（八）蛋白,Z,抗原检测,蛋白,Z,（,protein Z,，,PZ,）是二十世纪,90,年代发现的一种血液凝固调节蛋白，为,一种维生素,K,依赖的单链糖蛋白,，,由肝脏合成后分泌入血。在,Ca2+,和磷脂存在时，,PZ,可与蛋白,Z,依赖的凝血酶抑制物（,protein Z-dependent protase inhibitor,，,ZPI,）结合，并进一步与,FXa,形成,Xa-ZPI-PZ,复合物而使因子,Xa,在一分钟内失去,95,以上的凝血活性。,（八）蛋白,Z,抗原检测,检测方法：,ELISA,法,参考值：法国学者报道为,1.04,3.57mg/L,。,临床意义：,目前,PZ,在临床上的意义尚不十分明了。,Wasse,等研究发现,PZ,缺乏（,1.0 mg/L,）在缺血性脑卒中和健康对照中分别为,20,和,5,，二者具有显著性差异，,PZ,缺乏可使缺血性脑卒中的危险性提高,4,倍。,Sofi,等报道在急性冠脉综合征病人当中,PZ,水平明显低于健康对照，说明,PZ,缺乏是导致急性冠脉综合征的独立的危险因素。,（九）谷氨酸型纤溶酶（原）检测（,Glu-Pln,或,Glu-Plg,）,在微量纤溶酶（,Pln,）作用下，纤溶酶原（,Plg,）,NH,2,端的精（,68,）,-,蛋（,69,）及赖（,77,）,-,赖（,78,）,-,缬（,79,）被裂解，生成谷氨酸型纤溶酶原（,Glu-Plg,或,Glu-Pln,）和赖氨酸型纤溶酶原（,Lys-Plg,或,Lys-Pln,）。,Glu-Plg,约占,90,，,Lys-Plg,仅占,10,。,（九）谷氨酸型纤溶酶（原）检测（,Glu-Pln,或,Glu-Plg,）,检测方法：人血浆,Glu-Plg,（,Glu-Pln,）用双抗体夹心,ELISA,法检测。抗,Glu-Plg,（,NH2,端,1,65aa,）抗原表位的单抗（,LW5G5,）作为包被抗体，抗,Plg,（,Pln,）重链区单抗（,LW10F7,）作为酶标记抗体，二者构建人血浆,Glu-Plg,（,Pln,）双抗体夹心,ELISA,检测方法。,参考值：,213.945.8mg/L,（,n=220,，上海第二医科大学，医学检验重点实验室）,。,（九）谷氨酸型纤溶酶（原）检测（,Glu-Pln,或,Glu-Plg,）,临床意义：,Glu-Plg,（,Pln,）水平降低，反映纤溶酶原激活物（,t-PA,、,u-PA,）活性增强。见于原发性纤溶，重症肝病、肝硬化、肝叶切除术、门脉高压、肝移植、大型手术，前置胎盘、胎盘早剥、死胎滞留、妊高征、羊水栓塞，恶性肿瘤播散、严重感染，以及各种原因所致,DIC,等。,（十）流式细胞术在血栓与止血检验中的应用,（一）检测血小板功能缺陷症,1.,血小板计数,(Plt),尤其对,Plt,低的患者特别有用，误差,5%,。,2.,原发性血小板减少性紫癜,(ITP),对,ITP,，血小板表面免疫球蛋白,(pAIg),增加，血小板颗粒,(PMPS),增加，网织血小板增多。,3.,血小板无力症 血小板,Gp IIb/IIIa,减少,GP IIb/IIIa,与纤维蛋白原,(Fg),结合能力减低。,4.,巨大血小板综合征 血小板,Gp Ib/IX,表达减少。,5.,血管性血友病,(vWD),利用抗,vWF,单抗可以检测,vWF,与,GPIb,的结合能力减低,（十）流式细胞术在血栓与止血检验中的应用,（二）检测血栓性疾病,可以反映血小板激活的程度。血小板激活时，抗,GP I