补体参与的反应

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Part,补体参与的反应,Part,T细胞数量及其功能检测,实 验 三,免疫学教研室,王丽娜,Email：,补体参与的反应,补体的溶血反应,-,免疫血清的制备与应用,补体结合试验,T,细胞及其功能检测,E,花环形成试验,淋巴细胞转化试验：,形态学方法,3,HTDR,掺入法,MTT,比色法,T,细胞亚群检测：间接免疫荧光法,免疫组化法,-SABC,AP,法,主要内容,补体激活的三条途径,经典途径,MBL途径,旁路途径,IC+C1q,MBL+病原体配基,细菌+C3,膜攻击复合物,细胞溶解,Part,补体参与的反应,思考题,材料：绵羊红细胞、补体、免疫血清（自制）,问题：请设计实验检验你所制备的免疫血清的特异性？,1、补体的溶血反应,-,补体参与的反应,原理,绵羊红细胞（,SRBC,）作为抗原与其相应抗体,（溶血素）,结合后，通过,经典途径,激活补体，产生膜攻击作用，最后导致红细胞溶解，发生溶血反应。,孔号,SRBC,溶血素,补体,NS,1,3滴,3滴,3滴,3滴,2,3滴,3滴,6滴,3,3滴,3滴,6滴,4,3滴,9滴,结果,实验步骤及结果判断,阴性,阴性,阳性,溶血,溶血,不溶血,反应系统,指示系统,溶血反应,补体结合试验,补体,2、补体结合试验 -,补体参与的反应,原理,1,2,3,4,5,反应系统,Ab,Ag,补体,C,NS,摇匀，37C水浴，30mins,指示系统,溶血素,SRBC,摇匀，37C水浴，30mins,反应体系与结果判断,结果,溶血,结果,否,是,是,是,否,羊红细胞对照,Part,T细胞数量及其功能检测,1.E花环形成试验,原理,人外周血T细胞表面具有天然的能与绵羊红细胞(SRBC)表面糖肽相结合的受体（E受体），可结合SRBC形成花环样细胞团。,因为T细胞的异质性，它们对绵羊红细胞的亲和力不同，所以T细胞可以形成不同类型的E花环，如EtRFC（总花环）、EaRFC（活性花环）、EsRFC（稳定性花环）等。,检测,T,细胞数量，间接判断机体的细胞免疫状况。,CD2,实验器材,肝素抗凝血、绵羊红细胞（,SRBC,）,淋巴细胞分层液、,Hanks,液、,1640,培养液、,0.5,戊二醛固定液、灿烂甲酚兰染液,试管、滴管、离心机、微量移液器、玻片、显微镜等,实验步骤,密度梯度离心法分离外周血单个核细胞：,取稀释好的人外周血，用滴管贴管壁（倾斜30）轻轻叠加于2ml分离液上（界面要清晰）配平后2000rpm离心 10mins。,离心后分为5层，由上8而下分别为：稀释的血浆、单个核细胞、分离液、粒细胞、红细胞。,1.淋巴细胞悬液的制备：,动作轻柔；分清滴管及枪头！,稀释的血液,分层液,离心前,稀释的血浆,单个核细胞,分层液,粒细胞,红细胞,离心后,洗涤细胞：,另取一支滴管，,仔细,吸出位于血浆和分离液之间的,乳白色的单个核细胞,，放入盛有5mlHanks液的试管2000rpm离心5mins。弃上清（,倾倒时液体不要回流,），将沉淀的淋巴细胞轻弹混匀后加入Hanks液5ml，重复离心一次。,2.弃去上清，留经过洗涤的,淋巴细胞悬液,0.1ml与,绵羊红细胞,0.1ml、,1640营养液,0.1ml混合轻弹混匀后放于37温箱15mins。,3.,取出试管，500rpm离心5mins。（注意此步非常关键，,转速一定要慢,）室温静置3-5分钟。,4.取出试管，吸去半量上清液，轻轻,旋转混匀,，,沿管壁,滴加1滴戊二醛，轻轻混匀静置5mins。,5.取25ul液体滴片，加一滴灿烂甲酚兰染液，加盖玻片。,6.显微镜下观察。,E花环形成实验（灿烂甲酚兰染色，400）,实验结果,高倍镜下观察，计数100个淋巴细胞，计算花环形成率。淋巴细胞上结合,3,个SRBC者为E花环阳性。,正常参考值：EtRFC：64.46.7；,EaRFC：23.63.5；,EsRFC：3.32.6,实验结果,2.淋巴细胞转化试验,原理,T细胞在体外培养时，受到非特异性有丝分裂原(如PHA、ConA)或特异性抗原刺激后，可出现代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加、细胞体积增大并能进行分裂的淋巴母细胞，称,淋巴细胞转化现象,。,淋巴细胞转化率的高低，可反映机体的细胞免疫水平，故可作为测定机体免疫功能的指标。,常用方法,形态学方法,3,H-TDR掺入法,MTT比色法,胞核的大小、与胞浆的比例、胞浆染色性、核的构造与核仁的有无,成熟小淋巴细胞：,核染色深、没有核仁，胞浆少、染色为轻度嗜碱性；,淋巴母细胞：,体积增大，形态不规则，核变大、核质染色疏松，有核仁1-2个，胞浆丰富，常出现胞浆空泡；,其他细胞：,中性粒细胞在培养72小时后，绝大部分衰变或死亡呈碎片。,(1)形态学方法,-淋巴细胞转化试验,镜下结果,红细胞,未转化淋巴细胞,转化的淋巴细胞,淋巴细胞转化实验 瑞氏染色 10100,实验结果,淋巴细胞转化率,转换的淋巴细胞,转换的淋巴细胞未转化的淋巴细胞,100,正常参考值：80,3,H-TDR掺入法,-淋巴细胞转化试验,T细胞受到PHA或特异性抗原刺激后，发生有丝分裂，细胞进入S期，此时在细胞培养液中加入氚标记的胸腺嘧啶脱氧核苷（,3,H-TDR），可以被细胞摄入而掺入DNA中，通过-液体闪烁计数器测定,3,H-TDR的掺入量，判断细胞的增殖程度。,MTT比色法,-淋巴细胞转化试验,MTT为一种黄色可溶性物质，细胞活化增殖时通过线粒体能量代谢，将MTT代谢成蓝紫色的甲臢，沉积于细胞内或细胞周围，形成甲臢的量与细胞活化增殖的程度呈正比。甲臢经盐酸异丙醇溶解后呈紫蓝色，置于酶标仪下根据显色程度即可知道甲臢量并反映细胞活化程度。,MTT,F,ormazan,Insoluble,细胞上的CD分子相应鼠抗人单克隆抗体兔抗鼠IgG荧光抗体反复洗涤，荧光显微镜下观察，计数阳性细胞。,间接免疫荧光法,洗,涤,抗体,荧光标记抗Ig抗体,间接法,3.T细胞亚群检测,间接SABC-AP法,SABC：链霉亲合素生物素复合物,AP：碱性磷酸酶,生物素活化后可以标记抗体和酶，且不影响它们的活性；链霉亲合素同一定浓度的生物素、酶混合后，就能形成链霉亲合素(SA)-生物素(B)-酶(E)复合物(SAB,-E,C)。这种复合物中至少存在一个尚未被生物素占据的亲合素结合位点，可与生物素标记抗体结合。,3.T细胞亚群检测,基本过程,间接SABC-AP法,-T细胞亚群检测,CD分子,T细胞,一抗,（小鼠抗人CD3/CD4/CD8分子mAb）,二抗,（生物素化）,SABC（标有,AP）,底物,-,AP,-,AP,AP,-,T细胞亚群检测（免疫组化，400）,补体参与的反应,补体的溶血反应,补体结合试验,T,细胞数量及其功能检测,数量检测,E,花环形成试验,T,细胞亚群检测：间接免疫荧光法,免疫组化法,-SABC,AP,法,功能检测,淋巴细胞转化试验：,形态学方法,3HTDR,掺入法,MTT,比色法,小结,综合性实验免疫血清制备及应用,不但要注意实验怎么做，还要知道该试验的用途。,溶血反应的原理、步骤、结果及分析。,E,花环形成试验的原理、步骤（简单描述）、绘制镜下观察结果并进行简单分析。,绘制淋巴细胞转化试验（形态学方法）、,T,亚群检测的镜下观察结果。,实 验 报 告,通 知,下次实验课随堂考核,方式：笔试（闭卷）和操作,范围：与所学（操作、示教）实验有关的原理、结果及分析。,