真核基因组DNA的分离纯化

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,真核基因组DNA的分离纯化,核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都以与蛋白质结合的状态存在。真核生物的染色体DNA为双链线性分子，原核生物的染色体DNA、质粒及真核细胞器DNA为双链环状分子；有些噬菌体DNA为单链环状分子；,大多数生物体内RNA分子均为单链线性分子并具有不同的结构特点，如真核生物mRNA分子多数在3端带有polyA结构。,分离纯化核酸总的原则：,应保证核酸一级结构的完整性（完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的最基本要求）；,排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染。,无其他核酸分子的污染（如抽提DNA分子时应去除RNA分子）。,分离核酸 应注意以下几点：,减少化学因素对核酸的降解，,减少物理因素对核酸的降解：,防止核酸的生物降解：进行核酸分离时最好新鲜生物组织或细胞样品，若不能马上进行提取，应将材料贮存于液氮中或-70冰箱中。,核酸提取的主要步骤：,一般为破碎细胞，去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，沉淀核酸以去除盐、有机溶剂等杂质，最后得到纯化的核酸。,一、外周血白细胞DNA提取（NaI法）,【实验目的】,掌握NaI法提取外周血白细胞DNA的原理和方法。,【实验原理】,从全血制备白细胞DNA，可用双蒸水溶胀红细胞及白细胞膜，释放出血红蛋白及细胞核，使核酸处于易提取状态，加NaI破核膜并使DNA从核蛋白中解离，用氯仿/异戊醇抽提使蛋白质沉淀完全（异戊醇去泡沫），DNA存在于上层水相中，以37%异丙醇沉淀DNA，离心弃去异丙醇，并重复操作一次，即可获得白细胞DNA。,【实验材料】,1、高速离心机。,2、各种所需试剂,【实验方法】,1取新鲜抗凝血100 l置EP管中，离心10 000 r/min1 min。,2弃上清，加ddH2O 200 l，摇匀20 s。,3加6 mol/L NaI 200 l，缓慢倒置摇匀20 s。,4于管内加氯仿/异戊醇（24:1）400 l，摇匀20 s，离心12 000 r/min12 min。,5吸取上层水相360 l置一新Ep管中，加纯异丙醇200 l，摇匀20 s。,6室温放置15 min，离心14 000 r/min12 min。,7小心弃去上清，再加37%异丙醇1 ml（勿摇动），离心14 000 r/min12 min。,8小心弃去异丙醇，晾干。,9加50 l TE缓冲液溶解DNA，以琼脂糖凝胶电泳鉴定或-20保存。,【,注意事项,】,1标本必须新鲜，提取前细胞应保持完整。所用EP管、吸嘴等器物及ddH2O、试剂等应高压灭菌，操作尽量在4以下进行。,2混匀试剂、吸取上清等操作时应避免动作剧烈。,3弃异丙醇时动作应轻，切忌甩干，以免DNA丢失。,40.541倍的异丙醇可选择性沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA，tRNA及多糖不产生沉淀。一般不需在低温条件下放置。其缺点是易使盐类与DNA共沉淀；在DNA沉淀中的异丙醇难以挥发除去，所以常规需要70%的乙醇漂洗DNA沉淀物。,