表皮干细胞、肝干细胞课件

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2008,年,4,月,29,日星期二,9,时,5,分,21,秒,表皮干细胞的研究进展,引 言,1.,人体最大的器官,2.,维持外貌,3.,抵御微生物入侵,4.,紫外线辐射,皮 肤,角蛋白,角质化细胞,颗粒细胞,棘细胞,基底细胞,基膜,真皮,外界,迁移细胞,干细胞,分裂中的,干细胞,核解体,表皮层,哺乳动物皮肤剖面图（示干细胞）,(b),哺乳动物表皮增殖单位,迁移细胞,分裂中的干细胞,(a),皮肤剖面,1.,表皮干细胞的概念,表皮基底部具有不断增殖和分化能力的干细胞称为表皮干细胞,Epidermal stem cell,ESC,角质形成细胞干细胞,Keratinocyte stem cell,KSC,皮肤干细胞,Skin stem cel1,皮肤组织中的专能干细胞,成年组织干细胞,增殖分化为表皮中各种细胞成分,保持皮肤正常的表皮结构,2.,表皮干细胞的来源,表皮干细胞,胚胎干细胞,间充质细胞,已分化细胞,毛囊处的干细胞,造血或其他组织,隆凸,3.,表皮干细胞的分裂与分化,分化方式,1.,对称分裂,2.,不对称分裂,干细胞,TAC,有丝分裂后细胞,终末分化细胞,4,表皮干细胞的分布,分,布,初级表皮嵴,表皮基底层,胚胎期,成人,没有毛发的部位,:,位于与真皮乳头顶部相连的基底层,有毛发的皮肤,:,位于表皮脚处的基底层,6.,表皮干细胞的,典型特征,2.,自我更新能力,1.,慢周期性,3.,对皮肤基底膜的黏附,7.,表皮干细胞的标记物,细胞类型 常见标志物,表皮干细胞,1,整合素、,6,整合素、,P63,、,K15,、,K19,、,烟酸己可碱、,CD90,、,CD98,、,CD200,短暂扩增细胞,K5,、,K14,终末分化细胞,CD71,、,K1,、,K10,、,CX43,、,Dsg3,表,1,表皮细胞标记物,Table 1 markers of the epidermal cell,角蛋白,角蛋白（,keratins,）是表皮细胞的结构蛋白，它们构成直径为,10nm,的微丝，在细胞内形成广泛的网状结构。随着分化程度的不同，表皮细胞表达不同的角蛋白，因而角蛋白也可作为干细胞、定向祖细胞、分化细胞的鉴别手段。,表皮干细胞表达角蛋白,19,（,keratin19,K19,）,定向祖细胞表达角蛋白,5,和,14(keratin5,、,keratin14,K,5,、,K,14,),，,分化的终末细胞则表达角蛋白,1,和,10,（,keratin1,keratin10,K,1,、,K,10,）,毛囊角质形成细胞底角蛋白表达更为复杂，除上述地角蛋白以外，还有,K,6,K,16,K,17,的表达。,角蛋白,Keratin,整合素,11,、,21,、,31,、,64:,与层黏连蛋白结合,整合素,31:,与纤维黏连蛋白结合,整合素,21:,与胶原结合,表皮干细胞与基底膜的黏附作用是干细胞维持其特性的基本条件。表皮干细胞对基底膜的脱黏附是诱导干细胞脱离干细胞群，进入分化周期的重要调控机制之一,目前体外分离、纯化表皮干细胞也有利用干细胞对细胞外基质的黏附性来进行的,黏附分子,生长因子及其受体,表皮发育过程中骨形态发生蛋白,(BMPs),、成纤维细胞生长因子,(FGFs),及表皮生长因子,(EGFs),均可刺激表皮来源的培养细胞的增殖,这些生长因子以自分泌或旁分泌方式行使调节功能。,重要的是生长因子,FGFs,和,EGFs,家族。,二、表皮干细胞的鉴别,利用表皮干细胞最显著的两个特征即慢周期性和自我更新能力来鉴别在体与离体干细胞是最基本且可靠的实验手段。,表皮干细胞的慢周期性,:,可采用标记滞留细胞的分析方法识别在体的静息干细胞。,表皮干细胞的自我更新能力,:,在体外培养则表现为无限的增殖能力，形成细胞克隆。,用,1,整合素的抗体来鉴别表皮干细胞,:,表皮干细胞表面高表达,1,整合素，而有丝分裂后细胞及终末分化细胞不表达,1,整合素,.,角蛋白,8.,表皮干细胞的分化调控,内部遗传物质 外部环境,内源性因素：,细胞的结构蛋白，特别是负责细胞不对称分裂的蛋白,控制基因表达的转录调节因子,干细胞与非干细胞系子代细胞的染色体修饰,设置短暂性扩增分裂的生物钟,微环境,:,表皮干细胞壁龛,stem cell niche,包括：,邻近的各种细胞,细胞分泌的多种细胞因子,由膜蛋白介导的细胞间相互作用,整合素与细胞外基质。,9,表皮干细胞的临床应用,9.1,创伤修复,9.2,组织工程,9.3,基因治疗,9.4,整形美容,9.1,创伤修复,在美国，每年有,60,万人要割取皮肤去治疗皮肤癌；还有,1,万,-1.5,万人要进行皮肤移植以治疗严重的烧伤。,多年来人们一直试图通过刺激或诱导患者自身创面残存的上皮细胞来修复创面。表皮干细胞能主动地参与创面修复，促进创面再上皮化。,值得人们进一步深入研究的是，是否还存在由成熟的表皮细胞逆分化为表皮干细胞或表皮干细胞样细胞的机理,9.2,组织工程,将皮肤干细胞按组织工程的原理构建皮肤，已成为解决临床治疗中皮源缺乏的根本途径。,自体皮肤干细胞有望成为更可靠的种子细胞来源。,如果将来能像分离表皮干细胞那样分离出真皮干细胞，可为临床患者提供大量自体表皮或真皮细胞，构建全皮替代物，则不仅解决了皮肤移植中的免疫排斥问题，而且将开辟新的种子,细胞来源途径,。,9.3,基因治疗,表皮干细胞的无限自我更新和多向分化潜能使其成为基因治疗首选的靶细胞,治疗方法：,1,导入标志性基因或一个异源基因,2,使细胞内原有基因过度表达,3,基因打靶,4,诱导某个基因的突变等,表皮细胞编码整合素亚基,3,、,3,的基因突变，导致整合素表达异常，引起表皮与真皮的连接障碍。,大疱性表皮松解症,Mavilio,等把表达层黏连蛋白,53 cDNA(LAM5-bata3),的逆转录病毒载体转移到,LAMB3,缺陷的,JEB,患者表皮干细胞内进行体外培养，然后将这些细胞移植到患者病变部位。,在随后的,1,年内观察发现，移植部位皮肤完好，没有水疱、感染、炎症反应及免疫排斥反应，并且移植部位新生的表皮更新是由基因转染的干细胞维持的，这一现象说明基因治疗已经取得巨大成功。,9.4,整形美容,研究人员设计出,“,干细胞原位培植四维抗衰老美容整形手术,”,，即将干细胞原位培植皮肤再生技术应用于皮肤衰老整形中，同时在衰老组织的三维改变中，加上时间因素，根据研究对象的具体特点及要求，临床上给予最大满足。,9.,表皮干细胞的应用前景,异常组织结构中表皮干细胞的演变规律,从整体的角度出发，在异常组织或发生缺损的组织器官原位启动表皮干细胞的正调控机制,寻找更经济、更接近真皮基质的三维支架，促进表皮层与真皮层的有效整合,朗格罕细胞、黑色素细胞在表皮层中的再现以及真皮的血管化,28,美宝国际集团董事局主席、北京荣祥再生医学研究所主任医师徐荣祥教授,在一九九六年烧伤创面上找到皮肤器官原位再生的原始细胞,“,角蛋白十九型皮肤干细胞,”,，破解了人体皮肤器官原位再生之谜，成功实现人体其它器官原位利用普通组织再生，从而建立起人体组织器官再生医学，并获得美国专利。,徐荣祥于,2002,年,发表,“,五年内复制人体,206,个组织器官、转变,66,种癌细胞系,”,的宣言，在科学界、医学界激起轩然大波,。,29,徐荣祥,教授在皮肤干细胞原位再生方面取得了原创性的重大突破。他们对被烧伤的皮肤进行适当处理后，,成功地直接诱导上皮组织基底层的干细胞分化生成皮肤细胞,，使受伤的皮肤得以迅速康复。该技术显示我国干细胞研究已率先进入组织和器官的原位干细胞修复和复制阶段，在国际上处于领先地位。,10.,展 望,相信，在不久的将来，随着相关技术的发展和成熟，人类有望在时空上精确调控表皮干细胞，从而更好地为自身的健康服务。,肝干细胞,肝干细胞的发现,1956,年，,Farber,将肝内可能具有分化潜力的细胞描述为卵圆细胞,1958,年,Wilson,和,Leduc,提出肝干细胞的概念。,近年来，人们发现肝干细胞移植对急慢性肝脏疾病有明确的治疗作用，使之成为消化领域的研究热点。,肝干细胞的来源,分为肝源性肝脏干细胞和非肝源性肝脏干细胞,肝源性肝脏干细胞,：包括卵圆细胞、分化的肝细胞、胚胎肝细胞和胆管上皮细胞,非肝源性肝脏干细胞,：源于胚胎干细胞、骨髓造血干细胞、骨髓间充质干细胞及胰腺上皮干细胞等不同来源的肝脏干细胞,源于胚胎干细胞的肝干细胞,Hamazaki,等在体外成功地将小鼠,ES,细胞定向分化为成熟的肝细胞,该细胞能表达,AFP,、甲状腺转运蛋白、,A2,抗胰蛋白酶、白蛋白等肝细胞特征。,Hu,则在直接观察到体外,ES,细胞向肝细胞转化的过程中，发现在培养液中体外,ES,细胞能转化为可分泌,AFP,、白蛋白（,ALB,）的肝细胞。,来源于骨髓干细胞的肝干细胞,Lagasse,等将,骨髓组织细胞移植,给致死量放射线照射鼠，发现在受鼠肝脏中发现骨髓造血干细胞来源的成熟肝细胞，提示造血干细胞可以转化为肝细胞。,Theise,等将正常,雄性,小鼠,骨髓移植,到正常,雌性,小鼠体内，应用荧光原位杂交方法检查雌性小鼠肝脏细胞,Y,染色体，发现雌性小鼠肝脏的部分肝细胞表达,Y,染色体，提示骨髓干细胞在正常肝脏环境中能分化为肝细胞。,Petersen,等将,雄性大鼠骨髓干细胞,移植到致死量放射性肝损伤且肝细胞增生被抑制的,雌性,大鼠模型体内，发现该模型大鼠的部分肝脏细胞表达,Y,染色体，提示骨髓干细胞不仅在正常肝脏环境能分化为肝细胞，而且在肝脏某些病理的环境中也能分化为肝细胞。,胰腺上皮干细胞,胰腺中存在着肝脏前体细胞。,Wang,等用野生型,E.colilacZ,转基因小鼠胰腺细胞移植入同系,酪氨酸代谢酶基因,（,FAH,）突变的小鼠脾脏,在小鼠脾脏中能检测到,FAH,（,+,）的肝细胞团。,从胰腺分离的胰岛前体细胞在体外培养中可分化为肝上皮细胞，提示在胚胎发育过程中,一些原始的多能干细胞保持着未分化状态滞留在机体组织中。,胰腺肝脏细胞同源性的这一特征，为进一步的临床治疗提供了又一肝干细胞来源。,肝干细胞,的特征,位于胆小管和,Hering,管部,细胞体积较小,呈圆形或椭圆形,细胞质少,核质比例大,胞核呈卵圆形,故其被称为卵圆细胞,.,具有特殊的细胞标记：细胞表面高度表达,OV-6,、白蛋白、,细胞角质素,（,CK,）等,形态呈卵圆形。,卵圆细胞来自终末小胆管,Hering,管细胞,其数量与肝损伤的严重程度有关。在成年动物肝脏内肝卵圆细胞含量非常少,通常情况无法检测到。,肝干细胞的分离方法,目前分选、纯化肝干细胞的方法有密度梯度离心、流式细胞技术结合免疫荧光标记单克隆技术、免疫磁珠分选技术等。,密度梯度离心无需特殊仪器及抗体，操作过程简单，可减少复杂操作对细胞活性的损伤，采用,protease E,选择性破坏肝实质细胞，,20m,滤膜滤过清除体积较大细胞，后经,Percoll,密度梯度离心获得高产量及活性率的肝干细胞。,参与肝干细胞增生和分化的因子,包括干细胞因子及其受体,c-kit,系统,干扰素,肿瘤坏死因子,（,TNF-,）,白细胞介素,-6,（,IL-6,）,表皮生长因子（,EGF,）,转化生长因子,-,（,TGF-,）、,肝细胞生长因子（,HGF,）,成纤维细胞生长因子（,FGF,）家族等。,HGF,EGF,、,FGP,能促进骨髓干细胞的增生、分化,TGF-,能诱导骨髓干细胞的凋亡,而,TNP-,、,IL-6,对骨髓干细胞的生长无明显影响。,目前很难确定促进和诱导肝干细胞分化及扩增的关键因素，这也是影响肝干细胞临床应用的一个难题。,细胞移植治疗急慢性肝脏疾病,肝干细胞的移植方法较多,常用方法包括：腹腔移植、脾移植、门静脉移植、肝动脉移植等。,目前，动物实验进行较广泛，各种途径的移植应用于急慢性肝病的治疗,而临床上主要以肝动脉方式移植最为常用。,腹腔内移植,腹腔是干细胞移植最方便易行的治疗方法，但由于其有效的作用主要是通过肝脏受损伤