核酸提取及常见问题

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,DNA提取的几种方法,基因组,DNA,的提取,CTAB,法,SDS,法,其它,基因组DNA CTAB法,CTAB,法原理,（植物,DNA,提取经典方法）,CTAB,（,hexadecyltrimethylammonium,bromide,，,十六烷基三甲基溴化铵,），,是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。,该复合物在高盐溶液中（,0.7mol/L NaCl,）,是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。,注：,CTAB溶液在低于15,时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的,植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15,。,CTAB,提取缓冲液的经典配方,组份,Tris-HCl （pH8.0）,EDTA（pH8.0）,NaCl,CTAB,-巯基乙醇,终浓度,100 mM,20 mM,1.4M,2%(W/V),0.1%（V/V）使用前加入,Tris-HCl,（,pH8.0,）,提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；,EDTA,螯合,Mg,2+,或,Mn,2+,离子，抑制,DNase,活性；,NaCl,提供一个高盐环境，使,DNP,充分溶解，存在于液相中；,CTAB,溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；,-,巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除,基因组DNA CTAB法,CTAB,提取缓冲液的改进配方,组份,Tris-HCl（pH8.0）,EDTA（pH8.0）,NaCl,CTAB,PVP40,-巯基乙醇,终浓度,100 mM,20 mM,1.4M,3%(W/V),5%(W/V),2%（V/V）使用前加入,PVP,（,聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少,DNA,中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。,基因组DNA CTAB法,SDS,法原理,基因组DNASDS法,SDS,是一种阴离子去垢剂，在高温（,55,65,）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；,提高盐,(,KAc,或,NH,4,Ac),浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；,上清液中的,DNA,用酚,/,氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的,DNA,。,组份,Tris-HCl（pH8.0）,EDTA（pH 8.0）,NaCl,SDS,终浓度,10 mM,20 mM,0.4M,2%,SDS,法,DNA,提取缓冲液,基因组DNA其它方法,物理方式,：玻璃珠法、,超声波法、研磨法、冻融法,化学方式,：异硫氰酸胍法、碱裂解法,生物方式,：酶法,根据细胞裂解方式的不同有：,基因组DNA其它方法,吸附材料结合法：,根据核酸分离纯化方式的不同有：,硅质材料,阴离子交换树脂,磁珠,高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。,快捷高效。,低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。,适用于纯度要求高的实验。,磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。,基因组DNA其它方法,浓盐法,：,有机溶剂抽提法,：,密度梯度离心法：,利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离,有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用,利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物,质粒DNA碱裂解法,碱裂解法原理,染色体,DNA,比质粒,DNA,分子大得多，且染色体,DNA,为,线状分子，而质粒,DNA,为共价闭合环状分子；,当用碱处理,DNA,溶液时，线状染色体,DNA,容易发生变性，共价闭环的质粒,DNA,在回到中性,pH,时即恢复其天然构象；,变性染色体,DNA,片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒,DNA,分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。,质粒DNA碱裂解法,碱裂解法流程图,对数期菌体,溶液III中和,溶液I充分重悬,溶液II裂解,上清液,抽提,离心洗涤,酒精沉淀,干燥溶解,沉淀,质粒DNA溶液,质粒DNA煮沸法,煮沸法原理,染色体,DNA,比质粒,DNA,分子大得多，且染色体,DNA,为,线状分子，而质粒,DNA,为共价闭合环状分子；,当加热处理,DNA,溶液时，线状染色体,DNA,容易发生变性，共价闭环的质粒,DNA,在冷却时即恢复其天然构象；,变性染色体,DNA,片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒,DNA,分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。,细胞器DNA差速离心法,差速离心法原理,是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。,将待分离物质置于均匀介质（蔗糖,）,中，以一定的转速进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以分离。,线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋白，它们的,比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。,第一部分：DNA提取方法简介,第二部分：DNA提取常见问题、,原因分析及其对策,内容,第三部分：RNA提取方法简介,第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见,问题、原因分析及其对策,第二部分：DNA提取常见问题、,原因分析及其对策,DNA提取的基本步骤,I.材料准备,II.破碎细胞或包膜内容物释放,III.,核酸分离、纯化,IV.,沉淀或吸附核酸，并去除杂质,V.,核酸溶解在适量缓冲液或水中,材料准备,最好使用新鲜材料，,低温保存的样品材料不要反复冻融,提取血液基因组,DNA,时，要选择有核细胞（白细胞）,组培细胞培养时间不能过长，否则会造成,DNA,降解,含病毒的液体材料,DNA,含量较少，提取前先富集,基因组DNA的提取,质粒DNA的提取,使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加）,培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失,尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加大菌体用量,菌株不要频繁转接（质粒丢失）,细胞裂解,材料应适量，过多会影响裂解，导致,DNA,量少，纯度低,针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：,植物材料液氮研磨,动物组织匀浆或液氮研磨,组培细胞蛋白酶,K,细菌溶菌酶破壁,酵母破壁酶或玻璃珠,高温温浴时，定时轻柔振荡,基因组DNA的提取,质粒DNA的提取,菌体量适当,培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮,变性的时间不要过长（,5,分钟），否则质粒易被打断,复性时间也不宜过长，否则会有基因组,DNA,的污染,G,菌、酵母质粒的提取，应先用酶法或机械法处理，以破壁,核酸分离、纯化,采用吸附材料吸附的方式分离,DNA,时，应提供相应的缓冲体系,采用有机（酚,/,氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔,离心分离两相时，应保证一定的转速和时间,针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法,基因组DNA的提取,质粒DNA的提取,核酸分离、纯化,蛋白质的去除：,酚,/,氯仿抽提,使用变性剂变性（,SDS,、,异硫氰酸胍等）,高盐洗涤,蛋白酶处理,多糖的去除：,高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入,1/2,体积的,5M NaCl,，,高盐可溶解多糖。,用多糖水解酶将多糖降解。,在提取缓冲液中加一定量的氯苯,(1/2,体积,),，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。,用,PEG,8000,代替乙醇沉淀,DNA,：在,500L DNA,液中加入,200l 20%PEG,8000,(,含,1.2 M NaCl),，,冰浴,20min,。,核酸分离、纯化,多酚的去除：,在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：,-,巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等,加入易与酚类结合的试剂：如,PVP,、,PEG(,聚乙二醇,),，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与,DNA,的结合,核酸分离、纯化,盐离子的去除：,70,的乙醇洗涤,核酸沉淀、溶解,当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分,沉淀时加入,1/10,体积的,NaAc,（,pH5.2,，,3M,），,有利于充分沉淀,沉淀后应用,70,的乙醇洗涤，以除去盐离子等,晾干,DNA,，,让乙醇充分挥发（不要过分干燥）,若长期储存建议使用,TE,缓冲液溶解,TE,中的,EDTA,能螯和,Mg,2+,或,Mn,2+,离子，抑制,DNase,pH,值为,8.0,，可防止,DNA,发生酸解,基因组DNA的提取,质粒DNA的提取,DNA,中含有蛋白、多糖、多酚类杂质,DNA,在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应,DNA,中残留有金属离子,重新纯化,DNA,，,去除蛋白、多糖、多酚等杂质（具体方法见前）,重新沉淀,DNA,，,让酒精充分挥发,增加,70,乙醇洗涤的次数（,2-3,次）,DNA提取常见问题,问题一：,DNA,样品不纯，抑制后续酶解和,PCR,反应。,原因,对,策,材料不新鲜或反复冻融,未很好抑制内源核酸酶的活性,提取过程操作过于剧烈，,DNA,被机械打断,外源核酸酶污染,反复冻融,尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融,液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液,在提取内源核酸酶含量丰富的材料的,DNA,时，可增加裂解液中螯合剂的含量,细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔,所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌,将,DNA,分装保存于缓冲液中，避免反复冻融,DNA提取常见问题,问题二：,DNA,降解。,对,策,原因,实验材料不佳或量少,破壁或裂解不充分,沉淀不完全,洗涤时,DNA,丢失,尽量选用新鲜（幼嫩）的材料,动植物要匀浆研磨充分；,G,菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁,高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加,PK,的用量）,低温沉淀，延长沉淀时间,加辅助物，促进沉淀,洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒,DNA提取常见问题,问题三：,DNA,提取量少。,对,策,原因,第一部分：DNA提取方法简介,第二部分：DNA提取常见问题、,原因分析及其对策,内容,第三部分：RNA提取方法简介,第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见,问题、原因分析及其对策,第三部分：RNA提取方法简介,RNA提取的通用方法,异硫氰酸胍,/,苯酚法,原理：,细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；,释放出来的,DNA,和,RNA,由于在特定,pH,下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离,；,有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净,RNA,。,RNA提取的通用方法,异硫氰酸胍,/,苯酚法,步骤,:,材料准备：,尽量新鲜。,裂解变性,：,异硫氰酸胍,（,亚硫氢胍，巯基乙醇，,N-,月桂肌氨酸等）。,使细胞及核蛋白复合物变性，释放,RNA,，,有效抑制核酸酶。,纯化分离：,苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚,/,氯仿可抽提去除杂物。,洗涤：,70,乙醇。,沉淀：,异丙醇、无水乙醇。,乙酸钠（,pH4.0,）：,维持变性的细胞裂解液的,pH,值，沉淀,RNA,。,此外还常用氯化锂选择沉淀,RNA,。,RNA提取的通用方法,影响RNA提取的因素,材料,：,新鲜，切忌使用反复冻融的材料,如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮存在,TRIzol,或,样品贮存液中，于,70,或,20,保存,如要多次提取，请分成多份保存,液氮长期保存，,70,短期保存,影响RNA提取的因素,影响RNA提取的因素,样品破碎及裂解,：,根据不同材料选择不同的处理方法：,培养细胞：,通常可直接加裂解液裂解,酵母和细菌：,一般,TRIzol,可直接裂解，对于一些特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁,动植物组织：,先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快速，样品保持冷冻,样品量适当，保证充分裂解,为减少,DNA,污染，可适当加大裂解液的用量,影响RNA提取的因素,纯化：,在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速；,经典的纯化方法，如,LiCl,沉淀等，虽然经