蛋白质纯化方法

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,蛋白质的纯化方法,在外加电场作用下，带电的蛋白质颗粒在电场中移动的速度（v）取决于电场强度(E)，所带的净电荷(q)，蛋白质的分子量、分子形状以及与介质的摩擦系数(f)。,电泳法,几种常用的电泳,纸电泳,醋酸纤维薄膜电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE),(可分为圆盘电泳和垂直平板电泳）,琼脂糖凝胶电泳,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,等电聚焦(IEF),双向电泳,蛋白质的纯化方法,聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)是利用聚丙烯酰胺凝胶作为支持物的电泳法，聚丙烯酰胺凝胶是由单体,丙稀酰胺,和交联剂,甲叉双丙稀酰胺,交联而成的多孔网状凝胶。,不连续PAGE有分离胶、浓缩胶和样品胶。,PAGE分辨率很高。,电泳法,聚丙烯酰胺凝胶电泳法,电影,电泳过程,蛋白质的纯化方法,SDS（,十二烷基磺酸钠,）是一种阴离子型表面活性剂，它能够与蛋白质多肽链中的氨基酸残基按大约1,1.4比例结合。,每一个蛋白质分子都因为结合了许多的SDS而带有大量的负电荷，而蛋白质分子原有的电荷则可以忽略。该法主要利用了蛋白质分子量大小不同而分离蛋白质。,用已知分子量的蛋白质作为标准，则可以估算出不同蛋白质的分子量。,电泳法,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法,蛋白质的纯化方法,将两性电解质(eg:pH3-9，pH5-7),同蛋白质样品一起加入到已经灌好的凝胶中，在电场下，两性电解质首先达到它的等电点而平衡，蛋白质样品根据它自身的等电点分别向两极移动，最后也达到平衡。,等电聚焦：这种按等电点的大小，生物分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚焦的行为称,等电聚焦,。,电泳法,等电聚焦,等电聚焦的特点就在于它利用了一种称为两性电解质载体的物质在电场中构成连续的pH梯度，使蛋白质或其他具有两性电解质性质的样品进行聚焦，从而达到分离、测定和鉴定的目的。,蛋白质双向电泳,银染结果,考马斯亮染色为蓝色,连续电泳,几种常用的层析法,吸附层析,分配层析,离子交换层析,凝胶过滤层析,亲和层析,柱层析,蛋白质的纯化方法,此法是利用离子交换树脂作为柱层析支持物，将带有不同电荷的蛋白质进行分离的方法。,离子交换树脂可以分为阳离子交换纤维素,如羧甲基纤维素(,CM纤维素,）等，阴离子交换纤维素,如二乙基氨基乙基纤维素（,DEAE纤维素,）等。,带正电荷多的蛋白质与纤维素结合较强，而带正电荷少的蛋白质与纤维素结合则较弱。用不同浓度的阳离子洗脱液，如NaCl溶液进行梯度洗脱，通过Na,+,的离子交换作用，可以将带有不同正电荷的蛋白质进行分离。,层析法,离子交换层析法,蛋白质的纯化方法,层析法,离子交换层析法,蛋白质的纯化方法,此法又称为,分子筛层析,。凝胶过滤所用的介质是由交联,葡萄糖,、,琼脂糖,或,聚丙烯酰胺,形成的凝胶珠。凝胶珠的内部是多孔的网状结构。,Sephadex G10-G200(葡聚糖凝胶),Sepharose,2B,4B,6B(琼脂糖凝胶),Sephacryl S100,S200,S300,S400,(聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶),层析法,凝胶过滤法,分子筛层析的工作原理,也叫凝胶过滤层析,蛋白质的纯化方法,这是一种,高效分离纯化,蛋白的方法。其原理是不同的蛋白质分子对于固定化在载体上的特殊配基具有不同的识别和结合能力。,选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合作用的配基，然后应用化学方法将该配基与载体共价连接。将这种连接有配基的载体装入层析柱中，当含有待纯化的蛋白质溶液通过层析柱时，该蛋白质即与配基发生特异性结合而被吸附在层析柱上，而其它蛋白质则流出柱外。被特异性结合在层析柱上的蛋白质，可以用适当的配体洗脱液洗脱。,层析法,亲和层析法,蛋白质的纯化方法,常用的配基有抗体、抗原、激素或受体蛋白、酶的底物和抑制剂等。层析柱载体为琼脂糖凝胶等。,层析法,亲和层析法,蛋白质纯度等的测定,纯度和分子量的测定,：,采用电泳（如聚丙烯酰胺凝胶电泳）、分子筛层析、高速离心、高效液相色谱等技术测定。,等电点的测定,：,利用等电点时溶解度最低或等电聚焦方法测定。,亚基个数的测定,：,采用SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳方法测定。,G o H o m e,