《DNA的粗提取与鉴定》课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,DNA的粗提取与鉴定,讨论,2,：如何证明他们是遗传物质？,讨论,3,：怎样才能将细胞内的这些物质分离出来？,讨论,1,：构成生物体的遗传物质是什么？,1,、提取生物大分子的基本思路,选用一定的,物理或化学方法,分离具有不同物理或化学性质的生物大分子,2,、生物大分子,主要指,蛋白质、酶和核酸,3,、提取,DNA,的基本思路,利用,DNA,与,RNA,、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取,DNA,，去除其他成分,（一）提取,DNA,的方法,（,1,）,DNA,的溶解性,DNA,和蛋白质等其他成分在不同浓度的,NaCl,溶液,中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使,DNA,充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反,当氯化钠的物质的量浓度为,2 mol,L,时，,DNA,的溶解度最大，浓度为,0,14 mol,L,时，,DNA,的溶解度最低。利用这一原理，可以使,DNA,在盐溶液中溶解或析出,如何通过控制,NaCl,溶液的浓度使,DNA,在盐溶液中溶解或析出？,（,2,）,DNA,在酒精溶液中的溶解性,DNA,不溶于酒精溶液,，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精。利用这一原理，可以将,DNA,与蛋白质进一步分离,（,3,）,DNA,对酶、高温和洗涤剂的耐受性,蛋白酶,能水解蛋白质，但是对,DNA,没有影响,大多数蛋白质不能忍受,60,80C,的高温，而,DNA,在,80C,以上,才会变性,洗涤剂可以溶解细胞的,细胞膜,，去除脂质和蛋白质,但对,DNA,没有影响,1,、在沸水浴中，,DNA,遇二苯胺会染成,蓝色,，因此，二苯胺可以作为鉴定,DNA,的试剂,（二）,DNA,的鉴定,2,、甲基绿（绿色）,（一）,实验材料的选取,（二）,破碎细胞，获取含,DNA,的滤液,（三）,除去滤液中的杂质,(,纯化,),（四）,DNA,的析出与鉴定,二、实验设计,（一）实验材料的选取,1,、材料：鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌。（从中选取,2,3,种实验材料）,2,、原则：,选用,DNA,含量相对较高、容易提取的生物组织。,鸡血,3,、合适的材料：,原因：一是鸡血细胞核的,DNA,含量丰富，材料易得；二是鸡血细胞极易吸水涨破。,动物细胞的破碎较易，例如，在鸡血细胞液中加入一定量的,蒸馏水,，同时用玻璃棒搅拌，,过滤,后收集滤液即可,（二）破碎细胞，获取含,DNA,的滤液,1,、动物细胞,答：,蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗溶液，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，,从而释放出,DNA,。,讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？,2,、植物细胞,植物细胞需要先用一定的,洗涤剂和食盐溶解细胞膜,实例：提取洋葱,DNA,时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液,讨论：加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？,答：洗涤剂是一些离子去污剂，能,溶解细胞膜,，有利于,DNA,的释放；食盐的主要成分是,NaCl,，,有利于,DNA,的溶解,讨论：如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？,具体做法：,10mL,鸡血,20mL,蒸馏水,同方向搅拌,3,层尼龙布过滤滤液,答：研磨不充分会使细胞核内的,DNA,释放不完全,，,提取的,DNA,量变少,，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等,为什么反复地溶解与析出,DNA,，能够去除杂质,（三）去除滤液中的杂质,答：用高盐浓度的溶液溶解,DNA,，能除去在,高盐溶液,中不能溶解的杂质；用,低盐溶液,使,DNA,析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出,DNA,，就能够除去,与,DNA,溶解度不同,的多种杂质,方案一,、在滤液中加入,NaCl,，使,NaCl,溶液浓度为,2mol/L,，过滤除去,不溶的杂质,，再加入,蒸馏水,，调节,NaCl,溶液浓度为,0.14mol/L,，析出,DNA,，过滤除去,溶液中的杂质,，再用,2mol/L,的,NaCl,溶液溶解,DNA,。,讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？,答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的,DNA,与蛋白质分开；方案三利用的是,DNA,和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与,DNA,分离,方案二、直接在滤液中加入嫩肉粉，反应,10,15,分钟。,方案三、将滤液放在,60,75,0,C,的恒温水浴箱中保温,10,15,分钟。,为了纯化提取的,DNA,需要将滤液作进一步处理,讨论：此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？,答：可能含有核蛋白、多糖和,RNA,等杂质,具体做法,:,方案一：,30mL,滤液,35gNaCl,同方向搅拌,，,DNA,溶解加入,蒸馏水,DNA,析出过滤得到过滤物放到,2mol/LNaCl,溶液中溶解,DNA-NaCl,溶解液,方案二：,30mL,滤液嫩肉粉（木瓜蛋白酶）静置,10,15,分钟,DNA,滤液,方案三：,30mL,滤液,60,75,处理过滤获得,DNA,滤液,（四）,DNA,的析出与鉴定,DNA,的析出用的是与滤液体积相等的,冷却的酒精溶液（体积分数为,95,）,，静置,2,3min,，溶液中会出现,白色丝状物，,这就是粗提取,DNA,。用玻璃棒沿,一个方向,搅拌，卷起丝状物，并用,滤纸吸取上面的水,。,1,、,DNA,的析出,鉴定,DNA,时在试管中先加入物质的量的浓度为,2mol/L,的,NaCl,溶液,5ml,于两只试管中，其中一只加入,DNA,丝状物，各加入,二苯胺,4ml,试剂。混合均匀后，将试管置于,沸水中加热,5,min,待试管冷却后，比较两只试管中溶液颜色的变化，看看溶解有,DNA,的溶液是否有,蓝色,2,、,DNA,的鉴定,在沸水中加热的目的：加快颜色反应的速率,沸水加热：说明,DNA,对高温具有较强的耐受性,1,、以血液为实验材料时，每,100ml,血液中需要加入,3g,柠檬酸钠,，防止血液凝固。,2,、加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤的操作。加入酒精和玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，,以免加剧,DNA,分子的断裂，导致,DNA,分子不能形成絮状沉淀。,3,、二苯胺试剂要,现配现用,，否则会影响鉴定的效果。,制备鸡血细胞液,加,柠檬酸钠,，静置或离心,破碎细胞，释放,DNA,加,蒸馏水,，,同一方向,搅拌,过滤,，除去细胞壁、细胞膜等。,溶解核内,DNA,加入,NaCl,至,2mol/L,，,同一方向,缓慢搅拌,DNA,析出,加,蒸馏水,至,0.14mol/L,，,过滤,，在溶解到,2mol/L,溶液中,除去细胞质中的大部分物质。,DNA,初步纯化,与等体积,95,冷却酒精,混合，析出,白色,丝状物,除去核蛋白、,RNA,、多糖等。,DNA,鉴定,二苯胺，沸水浴，呈现蓝色,实验操作,2.,实验中,NaCl,的物质的量浓度为,2 mol,L,和,0.14 mol,L,对,DNA,有何影响,?,1.,在,DNA,的粗提取实验过程中，两次向烧杯中加入蒸馏水的作用是,(),。,A.,稀释血液、冲洗样品,B.,使血细胞破裂、降低,NaCl,浓度使,DNA,析出,C.,使血细胞破裂、增大,DNA,溶解量,D.,使血细胞破裂、提取含杂质较少的,DNA,答：,B,答：前者是溶解,DNA,，后者是使,DNA,析出,3.DNA,遇二苯胺,(,沸水浴,),会染成,(),A.,砖红色,B.,橘黄色,C.,紫色,D.,蓝色,4.,提取鸡血中的,DNA,时，为什么要除去血液,中的上清液,?,答：,DNA,的提取，关键是对杂质的去除，由于上清液是血液中的血浆部分，不含,DNA,，所以要除去上清液,(,含有蛋白质,),。,答：,D,