遗传病分析5DNA扩增产物鉴定

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,遗传病的分析,5,DNA,扩增产物的鉴定,限制性内切酶酶切技术,琼脂糖凝胶电泳技术,一、限制性内切酶酶切技术,原 理,限制性内切酶大多由大肠杆菌中提取纯化得到，能特异性识别和切割双链,DNA,分子中的特异序列（一般识别,4,6,个核苷酸序列）,由于大多数内切酶具绝对的位点特异性，因此可以选择合适的内切酶切割扩增产物，通过片段大小鉴定基因是否有缺失或缺陷。,原 理,本实验使用限制性内切酶（,Lwe,I,），酶切位点：,5.,G,CATC(N),5,3,3.CGTAG(N),9,.5,正常人样品具有酶切位点，能够被酶切开，分成,2,个片断；而病人组,G,则被,A,替代，酶切位点丧失，不能被酶所切动，所以还是个片断。,器材与试剂,高速离心机、恒温水浴箱、移液枪、枪头、塑料离心管等,Lwe,I,限制性内切酶、三蒸水、缓冲液等,操 作,1,、取样品,2,份（病人、正常人,PCR,扩增产物）,无菌,ddH,2,O 14ul,缓冲液,10 2ul,扩增产物,3.5ul,内切酶,0.5ul,2,、置,37,o,C,水浴,3h,（或过夜）,20ul,混匀,注意事项,内切酶需在,20,环境中保存。,内切酶活性的发挥需要,Mg,2,。,为使酶反应时达到最佳条件，需使用生产厂商提供的反应条件或缓冲液。,二、琼脂糖凝胶电泳技术,原 理,溴化乙啶（,EB,）是一种高度灵敏的荧光染色剂，用于观察琼脂糖凝胶中的,DNA,。,EB,用标准,302nm,紫外光透射仪激发并放射出橙红色信号，可用带,CCD,摄像头的凝胶成像处理系统拍摄。,一定量的,DNA,加入琼脂糖凝胶，能与凝胶中的,EB,结合，在,TAE,介质溶液中，进行电泳。由于电场作用，,DNA,分子会从,负,极向,正,极泳动，分子量小的泳动在前，大的在后，形成不同的,DNA,条带。此时用紫外透射仪可以检测之。,以标准,Marker,为参照物，可以得知被检,DNA,的大小。,器材与试剂,紫外透射仪、电泳仪、电泳槽、,凝胶板、凝胶梳、橡皮膏、薄膜、,移液枪、枪头、塑料离心管等,1,琼脂糖（含,EB,）、,DNA,样品、标准,Marker,、,溴酚蓝溶液、,TAE,缓冲液等,操 作,1,、制备,1%,凝胶板：,配置好的琼脂糖溶液加热溶解后，至,50-60,时，浇板；,冷却后，置电泳槽内，并轻轻拔出梳子。,2,、制备上样样品,3,份（,Marker,、病人及正常人酶切产物）：,每份样品在塑料薄膜上加：,溴酚蓝溶液,6 1ul,样品 ,ul,3,、点样：,吸取混合好的上样样品，轻轻加入琼脂糖凝胶孔内。,4,、电泳：,接通电源（,80mA,），约,30min,。,5,、鉴定：,取凝胶置紫外透射仪察看、照相、分析。,混匀,结 果,注意事项,溴化乙啶（,EB,）是强诱变剂，,具有高致癌性！,定义：,细胞培养,细胞分裂指数,细胞活率,细胞的生长曲线,细胞周期,细胞培养的生命周期,细胞系、细胞株,细胞“代”,微核,系谱分析,