临床微生物检验与临床

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,临床微生物检验与临床,临床微生物科 李 浩,微生物检验的重要性,在医学高度发展，新的抗菌药物不断涌现的今天，感染性疾病的发病率和病死率仍然居高不下。主要原因之一是当代的感染性疾病，在病原上发生了较大的变化，形成了现代感染性疾病在病原学上的新特点,现代感染性疾病的新特点,以条件致病菌为主：很多低致病、弱毒的细菌，在外环境、人体体表以及与外界相通的腔道中广泛存在的细菌，引起感染甚至造成严重后果的现象日益增多。,病原菌的种类更为广泛：包括需氧菌、厌氧菌、苛氧菌、分枝杆菌和真菌等。,细菌的耐药性不断增强：同一种细菌对抗生素的耐药性可以完全不同，甚至出现同时耐多种抗生素的“多重耐药”细菌，往往使临床医师的“经验性”治疗或所谓的常规治疗根本无效。,现代感染性疾病的新特点,提高感染样本送检率,加强细菌耐药监测,关注细菌性疾病的病原学诊断，已成为临床工作者、临床微生物与微生态工作者、药学家和从事感染控制的工作者共同关注的热门焦点。,病原微生物送检是感染控制的基础,成功治疗感染症的因素,成功分离病原菌,标本收集、运送、保存,标本处理方法,检验医师专业知识,医师判读病原菌培养结果,选择适当治疗方法,临床医生要合理用好两种数据,1. 本地区、本单位病原流行病学资料，指导经验用药。,（微生物室、院感科、临床科室）,2.药敏试验报告，纠正经验用药。,重视病原学检查,尽可能在应用抗菌药物之前留取标本送检。以提高病原学诊断率,为选药和调整药物提供依据。,“正确的微生物学检验始自正确的标本采取。临床医师、护师及检验技师都必须通晓其要领。”,著名的临床微生物检验专著Manual of Clinical Microbiology 的主编Patrick Murray,标本采集和运送是细菌培养成功的,最最重要,的关键, 但由于标本的采集和运送常由护士或医生或病人自己完成，所以也是最不容易做好的事情，而且不知道问题所在之处，造成的后果是:,临床医生最不能接受的问题:阳性率低,国内微生物标本的采集目前存在的问题 ：,标本送检率低,从全国来看，抗感染治疗前，送检相关标本可能只占应送标本的一半左右，与抗菌药物应用率之高形成鲜明的反差。一些医师在经验性治疗受挫后方送标本，此时已失去阳性培养的机会。,标本有缺陷,正确收集各种临床标本，关注特检标本采样与送检的方法和条件，是完成病原学诊断的先决条件。,微生物让人类步步为营，,我们应该追求：,“准确的病原学诊断”,“针对性病原学治疗”,正确的微生物标本采集和运送，是准确的病原学诊断的前提！,基本原则,1.及时采集微生物标本作病原学检查,2.在抗菌药物使用前采集标本,3.采样时严格执行无菌操作,4.采样后立即送检,5.标本容器须灭菌处理，但不得使用消毒剂,6.送检标本应注明来源和检验目的,常见不合格标本主要有以下问题：,标本采集时间错误,容器错误,标本量不足,标本采集延误,标本未及时正确运送,以及暂存条件错误。,。,最有价值的细菌学检测项目,血液培养,脑脊液培养,胆汁培养,胸腹水培养,关节液,其他无菌体液或分泌液,血培养标本,采集与运送,血培养是进行血流感诊断的最佳手段,目前血培养的问题,：,采血时机不合适,采血套数不够,采血量不足,只做需氧培养，不同时做厌氧培养,采血前或采血时正在使用抗生素治疗,相似规模医院的血培养数, 国内多数三甲综合医院2,10 瓶/天, 复旦大学中山医院20,50瓶/天, 香港玛丽医院200瓶/天, 台湾大学医院300瓶/天, 我院约10,15瓶/天,1370,瓶,/2011,年,7,月,26,日,美国，亚特兰大，埃默里大学附属一院，,1100,床位,平均,100,人次,/,天,美国，亚特兰大，埃默里大学附属二院，,900,床位,实验室类型:美国私立大医院微生物实验室医院病床数: 800 beds微生物标本量: 600个标本/天血培养标本量:150 瓶/天血培养标准采样:3套瓶/24小时 (1个需氧瓶+1个厌氧瓶=1套)阳性结果:10-30株需氧或兼性厌氧菌/天, 2株厌氧菌/月BacT/ALERT 3D 240 7台,“只有在发热时，才需要进行血培养。”,关于血培养指征,想采就采,答 案：血培养的指征,当怀疑血流感染或脓毒症时，应常规行血培养,怀疑患者有血流感染的症状有：,不明原因的发烧,(38)或体温过低(36),白细胞增多（ 10,000/ul），粒细胞减少（ 1,000ul）,休克，寒颤，僵直,严重的局部感染(脑膜炎，心内膜炎，肺炎，肾盂肾炎，腹部术后感染，),心率异常加快,低血压或高血压,呼吸频率加快,“何时采血进行血培养，无特殊时间要求。”,关于采血时机,你认为对吗？,为了提高病人血培养的阳性率，最好的抽血时间是：,A.发热开始时B.寒战开始时C.发热最高峰时D.寒战结束时E.预计寒战发热前,0,30,60,时间,(,分钟,),体温,血培养采血时机,细菌浓度,答 案：采集血培养样本的最佳时间,尽可能在患者寒战或开始发热时采血,在患者接受抗生素治疗前采血,如患者已经应用抗菌药物进行治疗，应在下一次用药之前采血培养,“为减轻患者痛苦，只从一个穿刺部位采一份血液标本即可。”,关于采血套数及部位,基本概念,成人“一套” 血培养应该包括需氧瓶和厌氧瓶各一个，也叫“一份”,注意：一次穿刺采血，算“一套”，采集第二套应从另一个穿刺点获得。,儿童一般只做需氧培养，但仍需从多个部位采集多次。特殊患者才考虑厌氧培养。,采血套数,Weinstein et al. Detection of Bloodstream Infections in Adults: How Many,BloodCultures Are Needed J Clin Microbiol. 2007; 45:3546-3548,表皮葡萄球菌的临床意义,2,3,套血培养，有助于污染的判断。,Tokars, JI. Clin Infect Dis 2004; 39:333,污染菌,致病菌,采集,1,套无法判断是病原菌还是污染菌。,答 案 ：关于血培养套数与采血部位,每位患者每次采血最少2套，3套更好,初发患者，绝不能只采1套标本,多个穿刺部位采血。因多部位同时发,生污染的几率较小，便于对结果进判断,“两套血培养采集间隔无特殊要求。”,关于采血间隔,答案：关于标本采集间隔时间,对于非持续性菌血症，同时或短时间内采集23套血培养，因为体内巨噬细胞吞噬系统会在1530min内清除掉进入人体内的细菌。,可疑急性心内膜炎患者要立即取血作血培养，30分钟内完成3套血培养的采集，采集后立即进行抗菌药的经验治疗。如果24小时内报告阴性，则继续采集2套血培养。,可疑的亚急性心内膜炎患者每间隔30分钟至1h采集1套，连续采集3套标本。如果24小时内报告阴性，则继续采集2套血培养。,“每瓶采集多少血液无特殊要求。”,关于采血量,菌血症病人血中细菌浓度,成年病人:,链球菌心内膜炎 1 to 30 organisms/ml,葡萄球菌心内膜炎 1 to 20 organisms/ml,革兰氏阴性菌血症 少于1 to 10 organisms/ml,革兰氏阳性菌血症 1 to 300 organisms/ml,幼儿病人:,革兰氏阴性菌血症 5 to 1000 organisms/ml,75%幼儿菌血症病人血液有100 organisms/ml,所以采血量一定要足够！,采血量(ml)与检出率的关系,Overall,血培养物每增加一毫升，真性菌血症,成年人微生物的检出率增加,3,但并非越多越好，超过一定数量的采血量会稀释培养瓶内的肉汤，使肉汤无法有效中和血中的抑制物质（补体、抗体、抗生素）。所以血液与肉汤的最佳比例为,1,：,4,1,：,10,答 案：关于采集血液量,采血量是影响灵敏度最关键因素,成人一份标本2个培养瓶（需氧厌氧），每瓶810ml，共20ml；要求至少采两份标本，即40ml。,儿童一般只需采集需氧瓶，在保证采集血量1总血量下，一般为13ml,采血量不足时应优先保证需氧瓶，因临床90以上的感染为需氧菌或兼性需氧菌感染,先采生化、凝血标本，再采血培养标本。”,关于,各种血液标本的采集顺序,血培养对无菌操作的要求比注射、采集生化、凝血等其它标本要高。,所以要最先采集血培养标本。,污染率的指标是, 3%,（100份标本里只能有不到3个标本出现污染。）,答案：采各种血液标本的先后顺序,“消毒的重点是足够量的消毒剂。”,关于皮肤及培养瓶消毒,皮肤消毒程序：,推荐使用碘町、洗必泰或碘伏作为皮肤消毒剂。,碘町作用,1min,碘伏作用,1.5-2min,洗必泰作用时间与碘町一样（但不能用于少于,2,个月婴儿皮肤消毒）,培养瓶的消毒程序：,去掉培养瓶口的塑料瓶盖。,75%,酒精消毒血培养瓶橡皮塞子,60,秒。,自然,待干,。,将标本注入培养瓶内。,5.,颠倒混匀标本与肉汤,，以避免血液凝集。,“培养瓶未使用时，需要冷藏或冷冻。”,关于,培养瓶的储存温度,不需冷藏，更不能冷冻。保存在,15,25,的室温即可，温度过低会导致对温度敏感的耐瑟氏菌等死亡。,答案：关于未用培养瓶的储存温度,“加入标本后的培养瓶夜班未能及时送到检验科，可以冷藏或放入35的温箱。”,关于,夜班血培养的送检,培养瓶夜班未能及时送到检验科，,存在室温即可，不能冷藏也不能放入35,的温箱 。,过夜不会对检测造成影响，但仍需尽快送检。冷藏可能导致对温度敏感的耐瑟氏菌等死亡。温箱会导致细菌进入生长对数期，从而错过检测的最佳时期。,答案：关于夜班血培养的送检,“患者静脉中插有导管，可直接从导管采血。”,关于,采血部位,不可以,，常规血培养不宜从静脉导管或静脉留置装置中采集，检出污染或定植菌的可能性较大。除非怀疑导管相关性血流感染，请参照导管相关性血流感染的采血方法。,答案：关于从静脉留置装置直接采血,有临床意义的分离株,Bourbeau PP et al. Routine incubation of BacT/ALERT FA and FN blood culture bottles for more than 3 days may not be necessary.,J Clin Microbiol. 2005; 43:2506-2509,结果表明培养的前三天，有临床意义分离株的,97%,被检出，培养前两天的检出率为,94%,。,97,痰培养标本,采集与运送,病原体种类繁多而复杂,使下呼吸道感染病原诊断成为难题,细菌（包括放线菌与奴卡菌，厌氧菌与分枝杆菌）,真菌（包括肺孢子菌）,病毒,支原体、衣原体与立克次体,原虫,寄生虫,咳痰途经口咽部,唾液中口咽部定植菌的浓度可达10,8,-10,9,/ml。,研究显示，国内常规痰标本中约半数存在唾液严重污染现象。,不可避免地受到污染,我国痰细菌培养现状,标本送检率低,苛养菌检出率极低,结果重复性差,报告速度慢,感染菌与污染菌不易区分,药敏结果与治疗反应存在差距,咳痰标本的采集,标本采集方法,医师或护士直视下采集标本,病人先漱口，去除表面的菌群,教育病人深咳，收集从下呼吸道咳出的痰液,临床上约半数咳痰标本不合格！,关于咳痰标本,在抗生素应用前采集痰标本;,标本采集后12h内必须立即进行实验室处理,咳痰标本应用最早且广泛，但也是最受争议的标本,取标本前应摘去牙托，清洁口腔如刷牙和漱口,深咳，采集标本过程中要有专业的医务人员指导,无痰可用35NaCl 5ml雾吸约5min导痰,也可用物理疗法、体位引流、鼻导管抽吸等法取痰,几种下呼吸道直接采集的标本,经气管穿刺吸引（transtracheal aspiration,TTA）,经胸壁针刺吸引（transthoracic needle aspiration, TNA,）,经支气管镜采样,支气管肺泡灌洗（,bronchoalveolar lavage, BAL）,经支气管镜直接吸引,防污染样本毛刷（protective specimen brush, PSB,）,开胸肺活检（,open-lung biopsy，OLB）,经人工气道吸引分泌物（endotracheal aspirates，ETA）,痰培养的送检次数,对于普通细菌性肺炎，,痰标本送检每天1次，连续23天。,不建议24h内多次采集，除非痰液外观性状出现改变；,怀疑分枝杆菌感染者，应连续收集3天清晨痰液送检；,标本质量,脓痰,粘液样痰,唾液,or,诱导痰,(?),带血痰,用革兰氏染色来评估 呼吸道标本是否合格,呼吸道标本的涂片评估模式,尿培养标本,采集与运送,尿培养标本,清洁中段尿,导尿导管尿,经耻骨上皮肤穿刺采集膀胱内尿液,送检标本以晨起第一次尿液为佳,不能立即送检者，可暂存4冰箱，但保存不超过8h,清洁中段尿液,尽量取早晨第一次尿液,弃去开始流出的尿液，以冲刷尿道口的细菌，取能代表膀胱部位病原菌的中段尿,详细告知病人以下操作步骤,女性病人,收集标本前用清洗液冲洗干净，从前向后仔细擦洗,尿道区域,分开阴唇，开始排尿,排出几毫升后，不停止尿流，采集中段尿,男性病人,回缩包皮并清洗龟头,排出几毫升后，不停止尿流，采集中段尿,导尿管尿液,集尿袋内的尿液不能用作培养；,导尿管末端的尿液也不能用于培养，因为很难避免没有尿道菌群污染。,留置导管尿液标本常通过专门的采样端口采集，不能把导尿管与尿袋拔开后收集尿液。,采样端口用酒精消毒；必要时，可先夹住导尿管但不能超过30分钟；将注射器针头插入采样端口，抽吸出尿液；注入无菌杯或试管中,耻骨上穿刺吸取尿液,常用于患儿、泌尿道厌氧菌感染或脊柱损伤病人等。,可避免尿道或会阴细菌的污染，但对膀胱内少量尿液的小儿难以实施。,可用于厌氧菌检测,出现如下情况时，怎样判断？,化脓和创伤标本采集,组织或器官的化脓性感染，其病原菌的来源可分为两类：,内源性,：感染源是炎症局部周围器官中的正常菌群，由于损伤等因素进入无菌状态的组织内，发生感染。,外源性,：感染源是存在于人体外部自然界的微生物，由于外伤和直接接触通过人体表面进入人体，造成感染,。,脓液的细菌学检查对于确定感染的种类（结核性或非结核性等）、提供药物敏感结果和指导临床治疗有重要的意义。,（一）标本采集,1,开放性感染和已溃破的化脓灶,标本采集前先用灭菌生理盐水拭去表面渗出物，尽可能用抽吸或将拭子深入伤口，紧贴伤口前沿取样，,从脓肿底部或脓肿壁取样，效果最好,。慢性感染，污染严重，很难分离到致病菌，可取感染部位下的组织，研磨成组织匀浆接种于适宜的培养基。,2,封闭性脓肿,局部消毒后用,针及注射器抽吸,脓肿壁，将所有物质置于无菌试管内送检，疑为厌氧菌感染时立即作床边接种或置于厌氧转运装置送检（针头插一橡皮塞隔绝空气）。但取样时，可能会带入与感染过程无关的定植细菌。,3,大面积创伤感染,：可取感染组织块或沾有脓汁的内层敷料送检。,（二）注意事项,细菌对干燥敏感,或只能采集少量标本时，用棉拭子采集标本后立即放入液体培养基内，或采标本前先将棉拭子沾少许肉汤以,保持标本湿度,。,对于不能立即送检的标本，应放4保存，培养淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟菌的标本除外。,尽可能在用药前采集标本。,采样前病灶局部应避免用抗菌药物或消毒剂。,革兰染色对标本进行评估。涂片中如出现上皮细胞提示标本已被污染。没有上皮细胞而有白细胞说明标本采集正确。,有的创伤均可有细菌污染，但不一定发生感染，因此对分离到的细菌要根据创伤的情况、菌量和种数，收集标本的处理过程、机体免疫力及抗生素的使用情况等多种因素来分析判断。,与临床沟通中常见问题,1,、我们想用的药物在药敏试验中 没有做？,可能是天然耐药,可能是药物的敏感性被其他药物所预报,与临床沟通中常见问题,2.,为什么有的菌报告很多种药物， 有的仅报告几种药物？,报告的药物种类根据细菌种类的不同而有所不同，如铜绿假单胞菌报告的药物较多，而肠球菌报告的药敏较少,与临床沟通中常见问题,3、是否能将所用的药都做药敏试验?,没有必要：,通过耐药机制和标志性药物可以预测其他抗菌药物的敏感性,没有可能：,不是所用药物都可以做药敏试验（需要药物在体外稳定，需要有操作标准和解释标准）,与临床沟通中常见问题,4.明显稀便，培养结果为何正常？,大便普通培养，通常只能鉴定志贺菌、沙门菌感染，致病性大肠杆菌我们没有鉴定血清。,怀疑霍乱时，需开霍乱弧菌培养。,可能病毒感染(轮状病毒)。,与临床沟通中常见问题,5,、培养阳性的细菌都需要用抗菌药物治疗吗？,不是的,培养阳性,感染，可能为污染,（血培养）,，可能为定植,（痰培养）,任何结果必须结合临床情况进行评价,（很重要）,感染部位的清创、引流、换药比使用抗菌药物更加重要,改善患者全身情况：器官功能支持，纠正酸碱平衡，电解质紊乱，低蛋白血症，高血糖等,与临床沟通中常见问题,6、选择药敏报告敏感的药物，为什么临床治疗无效？,体外药敏试验只能预测体内治疗效果，并不等同； 一般来说，耐药治疗无效； 敏感,治疗有效。,可能不是真正的致病菌（污染或定植菌）,细菌本身因素（如诱导耐药，生物被膜）,感染部位与药代动力学因素 给药剂量和用药方式,药敏试验药物中有些药物单独使用无效，但可以与其他药物联合用药,药物剂型及生物利用度（纯品、商品）,与临床沟通中常见问题,7、涂片镜检结果与培养结果不吻合？,涂片镜检是报告所有检见的细菌，而培养的目的是检出致病菌。,一些苛氧菌需在特殊的环境或培养基上才能生长。,与临床沟通中常见问题,8、取的明显就是脓液标本，为何鉴定报告为无菌生长？,我们做的是有氧培养，脓液可能为厌氧菌感染。,可能细菌被大量的中性粒细胞吞噬。,与临床沟通中常见问题,9、今天的培养结果怎么与前天的不一样？,取材是否规范。,痰标本，有时选优势菌做，就可能导致两次不一样。,与临床沟通中常见问题,10、一般培养不是三天出结果吗，今天第四天了怎么还没出来？,一般培养经48小时后，即第三天出报告，若需分离苛养菌的则第四天出报告。,谢谢!,