临床免疫定性实验的质量保证

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,临床免疫定性实验的质量保证,一、相关基础知识,质量保证,(Quality Assurance,QA),为一产品或服务满足特定质量,要求提供充分可信性所必要的有计划的和系统的措施。,也可以说是,为了提供信任表明实体能够满足质量要求,，而在质量体系中实施并根据需要,进行证实的全部有计划和有系统的活动,。,室内质量控制,（Internal Quality Control,IQC),由,实验室工作人员，采取一定的方法和步骤,，,连续评价本实验室工作的,可靠性程度,，旨在监测,和控制本实验室工作的,精密度,，提高本室常规工,作中批内、批间样本检验的一致性，以确定测定,结果是否可靠、可否发出报告的一项工作。,室间质量评价,（External Quality Assessment,EQA）,为客观比较一实验室的测定结果与靶值的差异，由,第三方机,构,，,采取,一定的,办法,，连续、,客观地评价实验室的结果,，发现误,差并校正结果，使,各实验室之间的结果具有可比性,。这是对实验,室操作和实验方法的,回顾性评价,，而不是用来评价实时的测定结,果的可接受性。当EQA用来为执业许可或实验室认证的目的而评价,实验室操作时，常描述为实验室能力比对检验（Proficiency,testing,PT）。,常用临床免疫检验方法,三大“标记”免疫检验技术:荧光标记、放射性核素标记和酶标,其它标记免疫测定技术：发光物标记、金标、镧系元素标记等,免疫沉淀和免疫凝集试验,实验方法的选择,公认的参考方法。,参照卫生部临床检验中心制定的临床检验操作规范中所推荐的方法。,根据权威部门发布的方法学评价结果，选用,线性关系好、灵敏度高、特异性强、稳定性好,的实验方法。,方法的评估,参数设定：真阳性 TP，真阴性 TN，假阳性FP，假阴性 FN,敏感性:患者中阳性百分率,公式：100,特异性:非患者中阴性百分率,公式,：,100,方法的评估,诊断效率:准确区分患者及非患者能力,公式：,100%,阳性预测值:在所有阳性结果中真患者百分率,公式：,100%,方法的评估,阴性预测值:在所有阴性结果中非患者百分率,公式：,100%,二、影响ELISA测定的因素,标本收集,实验室测定,报告和解释,灰区的设置,结果报告和解释,室内质控,样本的外源性干扰因素,：,标本溶血,标本被细菌污染,标本贮存时间过长,标本凝固不全,冷冻保存标本避免反复冻融,样本的内源性干扰因素,：,类风湿因子,补体,异嗜性抗体、治疗性抗体、自身抗体,溶菌酶,磷脂,药物小分子,总蛋白浓度,试剂盒的因素,固相材料:聚苯乙烯塑料,抗原:纯化、合成和基因工程抗原,抗体：多抗、单抗和基因工程抗体,酶结合物：酶免疫测定的核心成份,色原底物：OPD 和 TMB,运输贮存,仪器的校准与标定,酶标仪的校准一定要定时进行（一般使用频繁不超过半年，最多不超过一年）。,加样器及水浴用温度计均应进行计量校准后使用，前者可采用称重法校准，后者可到国家计量单位进行。,酶免疫测定操作中的注意事项,加样,温育,洗板,显色,比色,结果判断,结果报告及解释,加样,定期对移液器进行维护和校准,加样不可太快，避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。,全自动加样系统的标本,“,交叉污染,”,问题。,操作时差对结果的影响,温育,常采用的温育温度有 43、37、室温等。,温育所需时间与温度成反比，即温育温度高，则所需时间相对较短。,温育时，微孔板应置于水浴（浮于水面）或湿盒中，以使反应溶液的温度迅速与室温平衡。,“边缘效应”的排除:使用水浴或在将反应溶液加入至板,孔中时，将板和溶液均加热至温育温度,。,洗板,洗涤是ELISA测定过程中决定实验成败的关键步骤。,洗板液一般为含0.05%Tween20 的中性 PBS。,手工洗板要避免气泡残留孔内，洗板机洗板时，将洗液完全吸净，否则空白值将升高甚至出现“花板”现象。,机洗的次数要通过多次实验来确定。,显色,加入底物 A 和 B 后，应振荡混匀,当底物为 OPD(邻苯二胺）时，显色反应应避光进行；底物为TMB（四甲基联苯胺）时，要新鲜配制。,显色时间：建议在 37 下反应1530分钟后，终止反应比色测定。,比色,加酸终止显色反应后，比色测定前应振荡混匀,测定时，要注意酶标仪的波长是否已调至合适,最好选择,双波长,比色测定，双波长测定能去除背景的干扰，注意避免出现吸光度值为负值的现象,。,灰区的概念,ELISA“灰区”是把定量分析的正常值范围引入定性分析而建立的概念。即将CO值上下一段区域定为阳性可疑。处于“灰区”的样本，可通过确认试验或重复检测来确定到底是阳性还是阴性。如果重复检测仍然落在“灰区”，则结果可报“阳性”。,灰区的设置,灰区,”,的设置有二种方式：,CO（1CV,），CV为该试剂的批内CV(一般在15-20%)；,CO2s,，s为实验室做室内质控RCV常规条件下的变异）的标准差。,结果判断与报告,按照试剂盒确定的 Cut-off 值判断结果。,对于,“,灰区,”,的问题，报告方式引入,“,可疑,”,较为合理，同时对结果做必要的说明。,各试剂盒CO值差异及变异系数大等因素，结果缺乏可比性，位报告结果的不一致对于临床实验室来说是不可回避，也是目前医疗纠纷主要集中点和,“,结果互认,”,的最大障碍，所以必须引入阳性和弱阳性的报告方式。,ELISA检测的,原始存根,必须完整而全面地保存。,室内质量控制（IQC）,IQC是一个集体活动，不光是对实验室一次测定的有效性的判断，也反应了实验室测定趋势的变化。,IQC的失控不能做为处罚的依据，应建设性的找出失控的原因，针对其采取措施加以改进。,对IQC应定期进行评价,统计质控方法,质控物浓度的选择,每次（批）质控物的数量和放置位置,质控规则,Levey-Jennings质控图方法,“即刻法”质控方法,质控血清的选择,弱阳性质控血清：趋近测定下限的反应物浓度水平；能灵敏的反映试剂盒测定下限的改变，确保弱阳性标本不被漏检。,阴性质控血清：避免分析物和微生物之间出现交叉反应；能监测到出现假阳性反应常见的原因。,定性免疫测定质控物浓度的选择,阳性质控标本选择,：,可选择S/CO值减去三倍批间CV与该S/CO值的乘积（仍大于1的质控血清作室内质控用，计算公式：,S/CO（1-3CV%）1,S/CO比值可在1.54之间,弱阳性质控标本选择,：,选择,S/CO处于1.01.5,左右的质控血清以判断每次测定时试剂盒测定下限的有效性。,每块板质控物的数量及位置,23份弱阳性质控,23份阴性质控,随机放置血液标本中间,Levey-Jennings 质控图方法,基本的统计学含义：稳定条件下，在20个 IQC 结果中不应有多于1个结果超过2 SD（95.5%可信限）限度；在1000个测定结果中超过3 SD（99.7%可信限）的结果不多于3个。如以3 s 为失控限，假失控的概率为0.3%。,Levey-Jennings 质控图结合 Westgard 多规则质控方法,Westgard多规则质控方法,l,2S,：一质控点在 2S 之外应警惕。,1,3s,:,一质控点在 3S 之外，为失控。,R,4S,：连续 2 个质控点相差 4S。,4,1S,：连续 4 个质控点落同侧 1S 之外。,X,：连续 7 个质控点落均值一侧。,室内质控的现状及应对措施,对于抗体检测，尤其是竞争法检测HBeAb、HbcAb，由于不同试剂盒、不同检测方法间CO值存在差异及变异系数大等因素，结果缺乏可比性，在没有统一的判断标准、及明确的临床意义的情况下，引入,弱阳性,报告方式。,由于质控品不稳定，每个月需重新设立靶值,对位于,“,灰区,”,和弱阳性结果及少见模式结果进行复查，避免偶然因素及孔间差对结果造成影响,质控小结,定期召开质控分析会，讨论质量控制情况,要在常规条件下建立质控图参数，用S/CO比值绘制质控图,采用自制的质控物，是一种经济的方法，关键是要确保质控物的性质稳定,使用新批次的外部对照质控物时，必须重新绘制质控图。变异系数,(,cv,),小,于20,质控小结,建议长期和稳定地使用一种质量好的试剂盒，更换不同厂家的试剂盒后，必须重新绘制质控图。改用新批号试剂盒也应重新制作质控图。,发现质控结果失控，应填写报告单，上交质量负责人，分析原因并决定是否发出检测报告。,质控小结,根据不同质控工作的具体要求，在Westgard多规则方法中，实际采用的,“,多规则,”,本身并非严格的一成不变，而是可多可少，并可以用不同方式进行组合。,当失控时，能确定产生失控的分析误差的类型，有助确定失控原因以寻找解决问题的办法。,乙肝检验存在的问题,HBV基因组变异对病毒HBsAg和HBeAg测定影响问题，以及如何评价试剂盒对这些变异株的检测效能,HBcAb检测在保证输血安全中的意义,HBeAb、HBcAb溯源性问题,罕见模式的问题,检验科与临床的对话,检验医师要将新开展的新项目新方法向临床宣传，广泛征求临床医生的意见,检验医师要积极参与临床会诊，对检验结果进行分析和解释,检验科向临床提供检验申请单的正确填写方式，样本的采集方式，检验方法的可靠性和局限性；检验结果的适当解释,THANK YOU!,