发酵过程控制

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第七章 发酵过程控制,第一节,温度控制,第二节,pH,值控制,第三节,溶解氧控制,第四节,二氧化碳和呼吸商,第五节,菌浓和基质对发酵的影响,第六节,泡沫控制,第七节,补料控制,第八节,高密度发酵及控制,第九节,微生物发酵终点的判断,发酵体系特征,1,微生物细胞内部结构及代谢反应复杂；,2,生物反应器环境复杂；,3,系统状态时变性及包含参数复杂性。,发酵过程的主要控制参数,pH,值,： 显示发酵过程中各种生化反应的综合结果。, 温度,：不同的菌种，不同产品，发酵不同阶段所维持的温度亦不同。, 溶氧浓度,（,DO,值，简称溶氧）：一般用绝对含量,(mg,L),来表示，有时也用在相同条件下氧在培养液中饱和度的百分数,(,),来表示。, 基质含量：,定时测定糖,(,还原糖和总糖,),、氮,(,氨基氮或铵氮,),等基质的浓度。, 空气流量：,每分钟内每单位体积发酵液通入空气的体积，也叫通风比。, 压力：,罐压一般维持在,0.02,0.05,MPa,。, 搅拌转速：,控制搅拌转速以调节溶氧。以每分钟的转数表示。, 搅拌功率：,常指每立方米发酵液所消耗的功率,(kW,m,3,),。, 黏度,：细胞生长或细胞形态的一项标志，也能反映发酵罐中菌丝分裂过程的情况，通常用表观黏度表示之。,(10),浊度,：澄清培养液中低浓度非丝状菌的,OD,值与细胞浓度成线性关系。,(11),料液流量,(12),产物的浓度,(13),氧化还原电位：,限氧条件发酵用氧化还原电位参数控制则较理想。,(14),废气中的氧含量：,从废气中的氧和,CO,2,的含量可以算出产生菌的摄氧率、呼吸商和发酵罐的供氧能力。,(15),废气中的,CO,2,含量,：揭示产生菌的呼吸代谢规律。,(16),菌丝形态：,衡量种子质量、区分发酵阶段、控制发酵过程的代谢变化和决定发酵周期长短的依据之一。,(17),菌体浓度：,是控制微生物发酵的重要参数之一，特别是对抗生素次级代谢产物的发酵。常根据菌浓来决定适合的补料量和供氧量。,由以上参数计算得出的菌体生长比速、氧比消耗速率、糖比消耗速率、氮比消耗速率和产物比生成速率也是控制产生菌的代谢、决定补料和供氧工艺条件的主要依据，多用于发酵动力学的研究。,第一节 温度控制,1,发酵热,伴随发酵的进行而产生的热量叫,发酵热,；发酵热的产生引起发酵液温度变化。在发酵过程中，某些因素导致热的产生，另外一些因素又导致热量散失。,产热,散热,净热量堆积,发酵液的温度上升；,相反，产热小于耗热，温度下降。,下面具体分析产热和散热的因素。,1),生物热,Q,生物,在发酵过程中，菌体不断利用培养基中的营养物质，将其分解氧化而产生的能量，其中一部分用于合成高能化合物（如,ATP,）提供细胞合成和代谢产物合成需要的能量，其余一部分以热的形式散发出来，这散发出来的热就叫生物热。,微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热多。,生物热与发酵类型有关,微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热多,一摩尔葡萄糖彻底氧化成,CO,2,和水,好氧：产生,287.2,千焦耳热量，,183,千焦耳转变为高能化合物,104.2,千焦以热的形式释放,厌氧：产生,22.6,千焦耳热量，,9.6,千焦耳转变为高能化合物,13,千焦以热的形式释放,二个例子中转化为高能化合物分别为,63.7,和,42.6,特点：,具有时间性；,具有生物特异性；,与营养有关；,如果培养前期温度上升缓慢，说明菌体代谢缓慢，发酵不正常。如果发酵前期温度上升剧烈，有可能染菌，此外培养基营养越丰富，生物热也越大。,2),搅拌热,Q,搅拌,在机械搅拌通气发酵罐中，由于机械搅拌带动发酵液作机械运动，造成液体之间，液体与搅拌器等设备之间的摩擦，产生可观的热量。搅拌热与搅拌轴功率有关，可用下式计算：,Q,搅拌,P8604186.8,（焦耳,/,小时）,P,搅拌轴功率,散热的情况,：,蒸发热：,空气经发酵液时，发酵液中有部分水汽化，变成水蒸气，随空气一起排出罐外，这部分水汽化时带走的热量用,Q,蒸发,表示，假设进出口气体温度相同，则由通气带走的热量为：,Q,蒸发,=G,（,I,出,-I,进,），,G,：空气流量；,I,：气体热焓；,辐射热：,通过罐体表面向环境中发射红外线而散失的热量。热量的大小决定于罐内外温度差大小、罐的表面积等。冬天大一些，夏天小一些，一般不超过发酵热的,5,。,发酵过程中，发酵液温度变化取决于上面几个因素,：,Q,发酵,= Q,生物,+ Q,搅拌,- Q,蒸发,- Q,辐射,2,发酵热的测量及计算,发酵热的测定可采用以下几种方法：,利用热交换原理,:,测量冷却水进出口的水温，再从水表上得知每小时冷却水流量来计算发酵热。,Q,发酵,= G*Cm,（,t,2,t,1,）,/V,Cm,水的比热,G,冷却水流量,利用温度变化率,S,（,/h,）：先使罐温恒定，再关闭自控装置，测量,S,，根据,Q,发酵,=,（,M,1,*C,1,+ M,2,*C,2,）,S,热力学方法：,根据盖斯定律：,“,在恒压和横容条件下，一个反应不论是一步完成或几步完成，其反应热是相同的,”,。这实际上是热力学第一定律的必然推论，因为焓（,H,）是状态函数，过程的焓变与途径无关，只决定于过程的始态和终态。发酵热可根据标准燃烧热或标准生成热来计算。,H,（,H,）反应物（,H,）产物,计算时，首先查出发酵所用的各种原料及产物的标准生成热或燃烧热，再根据实际发酵中，各原料的消耗及产物的生成量，利用上述公式即可求出过程的焓变。,3,温度对微生物生长的影响,任何微生物的生长温度均在一定范围内，可用最高温度、最适温度和最低生长温度进行描述；,温度影响微生物生长的机理,(1),影响酶活性。,(2),影响细胞膜的流动性。,(3),影响物质的溶解度。,在微生物培养过程中，生长速率的变化可描述为：,上式表明：实际比生长速率是生长与死亡速率平衡的综合反映。,、,均与温度有关，其关系可由,Arrchnius,公式来描述：,不同微生物的生长对温度的要求不同，根据它们对温度的要求大致可分为四类：嗜冷菌适应于,0,26,0,C,生长，嗜温菌适应于,15,43,0,C,生长，嗜热菌适应于,37,65,0,C,生长，嗜高温菌适应于,65,0,C,以上生长。,温度对微生物生长的影响具体表现在：,(1),有最适宜温度范围。,(2),不同生长阶段微生物对温度的反应不同。,T,V,最低,最适,最高,4,温度对发酵的影响,(1),影响产物生成速度,(2),影响基质消耗,(3),影响产物种类,a.,改变体内酶系中间产物种类产物种类,;,b.,使代谢比例失调；,5,温度的控制,由于微生物在生长和发酵过程中，对温度有以上要求，在生产上，为获得较高的生产率，针对所用菌种的性，在发酵周期的各阶段需要进行温度控制，提供该阶段微生物活动的最适温度。,温度还影响基质溶解度，氧在发酵液中的溶解度也影响菌对某些基质的分解吸收。因此对发酵过程中的温度要严格控制。,最适温度的选择,1,）根据菌种及生长阶段选择,微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，所要求的温度范围也不同。,如黑曲霉生长温度为,37,0,C,；,谷氨酸产生菌棒状杆菌的生长温度为,30,32,0,C,；,青霉菌生长温度为,30,0,C,。,前期菌量少，取稍高的温度，使菌生长迅速；,中期菌量已达到合成产物的最适量，发酵需要延长中期，从而提高产量，因此温度要稍低一些，可以推迟衰老。因为在稍低温度下氨基酸合成蛋白质和核酸的正常途径关闭得比较严密有利于产物合成。,后期产物合成能力降低，延长发酵周期没有必要，就又提高温度，刺激产物合成到放罐。,2,）根据培养条件选择,温度选择还要根据培养条件综合考虑，灵活选择。,通气条件差时可适当降低温度，使菌呼吸速率降低些，溶氧浓度也可髙些。,培养基稀薄时，温度也该低些。因为温度高营养利用快，会使菌过早自溶。,3,）根据菌生长情况,菌生长快，维持在较高温度时间要短些；菌生长慢，维持较高温度时间可长些。培养条件适宜，如营养丰富，通气能满足，那么前期温度可髙些，以利于菌的生长。,总的来说，温度的选择根据菌种生长阶段及培养条件综合考虑。要通过反复实践来定出最适温度。,第二节,pH,值的控制,1 pH,值对菌体生长和代谢产物形成的影响,pH,表示溶液氢离子浓度的负对数，纯水的,H,+,浓度是,10-7mol/L,，因此,pH,为,7,，,pH,7,呈碱性，,pH,7,呈酸性，,pH,值差,1,时，其,H,+,浓度就相差,10,倍。,最高、最适、最低三基点，主要是影响微生物活动环境的,离子强度、细胞膜的透性及膜上的带电性和氧化,-,还原电位、酶活性。,不同种类微生物，对,pH,要求不同；,同种微生物对,pH,变化的反映不同。,如，石油代蜡酵母,pH 3.5,5.0,生长良好，不易染菌；,pH 5.0,时，易染细菌；,pH 1.1,，糖经,EMP,生成乙醇。,不同基质，菌的,RQ,不同。,以延胡索酸为基质，,RQ=1.44,；,以丙酮酸为基质，,RQ=1.26,；,E. Coli,以琥珀酸为基质，,RQ=1.12,；,以乳酸为基质，,RQ=1.02,以葡萄糖为基质，,RQ=1.00,。,不同阶段，,RQ,不同,菌体生长,0.909,，,青霉素发酵的理论呼吸商： 菌体维持,1,，,青霉素合成,4,。,发酵早期，主要是菌生长，,RQ1,；,过渡期：维持菌体生命活动，产物逐渐形成，基质葡萄糖的代谢不仅仅用于菌体生长，,RQ,比生长期略有增加。,产物形成期：对,RQ,的影响较为明显，如产物还原性比基质大，,RQ,增加；产物氧化性比基质大，,RQ,就减少。其偏离程度决定于每单位菌体利用基质所形成的产物量。,RQ,是碳能源代谢情况的指示值。,碳能源完全氧化，,RQ,达到完全氧化理论值,碳能源不完全氧化，,RQ,异常。,实测,RQ,值低于理论值,因为：不完全氧化的中间代谢物,存在多种碳源,如青霉素发酵，,RQ,为,0.5,0.7,，且随葡萄糖与消泡剂加入量之比而波动。,一些碳能源基质的理论呼吸商,4 CO,2,浓度的控制,CO2,在发酵液中的浓度变化不像溶氧那样，没有一定的规律。,CO,2,在发酵液中的浓度大小受到许多因素的影响：菌体呼吸强度、发酵液流变学特性、通气搅拌程度、外界压力大小、设备规模大小也有影响。,CO,2,浓度控制应随它对发酵的影响而定。,CO,2,抑制产物合成：降低浓度；,CO,2,促进产物合成：提高浓度。,调节,CO,2,的手段,补料,通气搅拌调节,CO,2,的溶解度,调节罐压也可影响,CO,2,的浓度，对菌体代谢和其他参数也产生影响。,CO,2,形成的碳酸，可用除,CaCO,3,以外的碱来中和。,第五节 菌体浓度与基质对发酵的影响及其控制,1,菌体浓度对发酵的影响,菌体（细胞）浓度,(cell concentration),：单位体积培养液中菌体的含量。,反映菌体细胞的多少，而且反映菌体细胞生理特性不完全相同的分化阶段。,可据此算出菌体的比生长速率和产物的比生成速率等有关动力学参数。,菌体生长的影响因素,遗传特性,取决于细胞结构的复杂性和生长机制，细胞结构越复杂，分裂所需的时间就越长。典型的细菌、酵母、霉菌和原生动物的倍增时间分别为,45 min,、,90 min,、,3 h,和,6 h,左右，这说明各类微生物增殖速率的差异。,营养物质,各种碳源和氮源等成分和它们的浓度。上限浓度、基质抑制（渗透压、关键酶）。,环境条件,温度、,pH,值、渗透压和水分活度等因素。,菌浓的大小对发酵产物的得率的影响,在适当的比生长速率下，发酵产物的产率与菌浓成正比关系，即,P=Q,Pm,X,P,发酵产物的产率，,g,(,Lh,),；,Q,Pm,产物最大比生成速率，,h-1,；,X,菌体浓度，,g,L,。,菌浓过高会产生其他的影响：营养物质消耗过快，培养液的营养成分发生明显的改变，有毒物质的积累，溶氧下降，会对发酵产生各种影响。,基质对发酵影响及其控制,基质过浓导致抑制作用。当葡萄糖浓度低于,100,150 g,L,，不出现抑制作用；当葡萄糖浓度高于,350,500 g,L,，多数微生物不能生长，细胞出现脱水现象。,培养基过于丰富，菌体生长过旺，黏度增大，传质差，菌体不得不花费较多的能量来维持其生存环境，即用于非生产的能量大量增加。,）碳源对发酵的影响及其控制,迅速利用的碳源能较迅速地参与代谢、合成菌体和产生能量，并产生分解代谢产物，有利于菌体生长，但有的分解代谢产物阻遏产物合成；,缓慢利用的碳源多数为聚合物，为菌体缓慢利用，有利于延长代谢产物的合成。,例如，乳糖、蔗糖、麦芽糖、玉米油及半乳糖分别是青霉素、头孢菌素,C,、盐霉素、核黄素及生物碱发酵的最适碳源。,碳源的浓度：营养过于丰富对菌体的代谢、产物的合成及氧的传递都会产生不良的影响。若产生阻遏作用的迅速利用的碳源用量过大，则产物的合成会受到明显的抑制；反之，仅仅供给维持量的碳源，菌体生长和产物合成就都停止。,控制碳源的浓度：,经验法：根据不同代谢类型来确定补糖时间、补糖量和补糖方式。,动力学法：根据菌体的比生长速率、糖比消耗速率及产物的比生成速率等动力学参数来控制。,2,）氮源对发酵的影响及其控制,影响产物合成的方向和产量,如：,谷氨酸发酵,NH,4+,供应不足，促使形成,-,酮戊二酸；,NH,4+,过量，促使谷氨酸转变成谷氨酰胺。,控制适量的,NH4+,浓度,迅速利用的氮源：氨基,(,或铵,),态氮的氨基酸,(,或硫酸铵等,),和玉米浆等；容易被菌体所利用，促进菌体生长，但对某些代谢产物的合成，特别是某些抗生素的合成产生调节作用，影响产量。,缓慢利用的氮源：黄豆饼粉、花生饼粉、棉子饼粉等蛋白质。延长次级代谢产物的生产期、提高产物的产量。一次投入全量容易促进菌体生长和养分过早耗尽，以致菌体早衰自溶，缩短产物的生产期。,生产上采用的方法：,设计发酵培养基：选用含有快速利用和慢速利用的混合氮源。,补加有机氮源 酵母粉、玉米浆、尿素等。,补加无机氮源：氨水或硫酸铵,营养条件的选择,1,）种类的选择,生长阶段：营养物要全面,产物生成阶段：给予发酵所需的各种营养，前体、促进剂,混合氮源和混合碳源,2,）浓度,3,）比例的选择,根据培养基化学组成和菌体需要,根据动力学原理进行优化 碳氮比,根据营养物特性进行调整,操作方法：,首先要确定基础培养基配方中有适当的配比。,然后通过中间补料来控制：，磷酸盐。,可利用菌体代谢产生的,CO,2,量来控制生产过程的补糖量，以控制菌体的生长和浓度。,第六节 泡沫的控制,1,泡沫的产生、性质及变化,形成条件：,气,-,液两相共存；,表面张力大的物质存在；,发酵过程中泡沫有两种类型：,一种是发酵液液面上的泡沫，气相所占的比例特别大，与液体有较明显的界限，如发酵前期的泡沫；,另一种是发酵液中的泡沫，又称流态泡沫,(fluid foam),，分散在发酵液中，比较稳定，与液体之间无明显的界限。,发酵过程泡沫产生的原因,（,1,）通气搅拌的强烈程度,发酵前期培养基成分丰富，易起泡。,（,2,）培养基配比与原料组成,前期培养基营养丰富粘度大，产泡沫多而持久。,（,3,）菌种、种子质量和接种量,菌种质量好，生长速度快，可溶性氮源较快被利用，泡沫产生几率也就少。菌种生长慢的可以加大接种量,。,（,4,）灭菌质量,培养基灭菌质量不好，糖氮被破坏，抑制微生物生长，使种子菌丝自溶，产生大量泡沫，加消泡剂也无效。,泡沫的形成一般有以下几种规律：,整个发酵过程中，泡沫保持恒定的水平；,发酵早期，起泡后稳定地下降，以后保持恒定；,发酵前期，泡沫稍微降低后又开始回升；,发酵开始起泡能力低，以后上升；,泡沫体系的三阶段变化,(1),气泡大小分布的变化,液膜包裹的一个气泡，气泡膜有表面张力，气泡中压力大于气泡外的压力。气泡大小的再分布，就是由气泡膜内气体的压力变化引起的。气泡中气体压力的大小，依赖气泡膜的曲率半径,。,（,2,）气泡液膜变薄,取一杯泡沫，放置一段时间，就会在杯底部出现一些液体，而逐渐形成液相及液面上的泡沫相这样具有界面的两层。底部出现的液体一部分是泡沫破灭形成的，一部分是气泡膜变薄，排出液体形成的。,泡沫生成初期，泡沫液还比较厚，以后因蒸发排液而变薄，泡沫液会受重力的影响向下排液，泡沫液随时间延续而变薄。,（,3,）泡沫破灭,泡沫由于排液，液量过少，表面张力降低，液膜会急剧变薄，最后液膜会变得十分脆弱，以至分子的热运动都可以引起气泡破裂。因此只要泡沫液变薄到一定程度，泡沫即瞬间破灭。,泡沫层内部的小气泡破灭后，虽一时还不能导致气液分离，只是合并成大气泡，但排液过程使泡膜液量大幅度减少，使合并成的大气泡快速地破灭，最后泡沫体系崩溃，气液分离。,影响泡沫稳定性的因素,引起危害，需要消除的，只是稳定的泡沫。泡沫的稳定性受液体、气体许多性质的影响。不同介质的泡沫，稳定程度相差很多，影响泡沫稳定性的因素十分复杂，概括国内外研究者的说法，主要因素一下几种,1,）泡径大小,大泡易于破灭，寿命较长的的都是小泡。,因为：,泡越小，合并成大气泡的历程就越长；,小气泡的泡膜中所含液量相对比较大，所以较能经受液体流失所造成的稳定性的损失；,气泡越小，上升速度越慢，给表面活性剂的吸附提供充足的时间，增加了稳定性。,2,）溶液所含助泡物的类型和浓度,（,1,）降低表面张力,降低表面张力会降低相邻气泡间的压差。压差小，小泡并入大泡的速度就慢，泡沫的稳定性就好。,（,2,）增加泡沫弹性,助泡的表面活性剂，吸附在气液界面上，使表面层的组分与液相组分产生差别，因而使泡沫液具有弹性。,（,3,）助泡剂浓度,溶液中助泡剂浓度增加，气液界面上的吸附量就增加，液膜弹性随之增加，泡沫稳定性增高。,到达临界胶束浓度后，气液界面上的定向排列“饱和”，弹性不会再增加。,3,）起泡液的粘度,某些溶液，如蛋白质溶液，虽然表面张力不高，但因粘度很高，所产生的泡沫非常稳定。因为粘稠的液膜，有助于吸收外力的冲击，起到缓冲的作用，使泡沫能持久一些。液体粘度对泡沫稳定性的影响比表面张力的影响还要大。,4,）其它,*温度 表面张力最低值时的浓度随温度变化。,*,pH,影响助泡剂的溶解度和表层的吸附状态,*表面电荷 离子型表面活性剂，由于离子间静电的排斥，阻碍着离子彼此接近，减少排液速度，延缓泡沫变薄过程，使泡沫稳定。,2,泡沫对发酵的影响,1,）降低生产能力,在发酵罐中，为了容纳泡沫，防止溢出而降低装量,2,）引起原料浪费,如果设备容积不能留有容纳泡沫的余地，气泡会引起原料流失，造成浪费。,3,） 影响菌的呼吸,如果气泡稳定，不破碎，那么随着微生物的呼吸，气泡中充满二氧化碳，而且又不能与空气中氧进行交换，这样就影响了菌的呼吸。,4,） 引起染菌,由于泡沫增多而引起逃液，于是在排气管中粘上培养基，就会长菌。随着时间延长，杂菌会长入发酵罐而造成染菌。大量泡沫由罐顶进一步渗到轴封，轴封处的润滑油可起点消泡作用，从轴封处落下的泡沫往往引起杂菌污染。,3,泡沫的控制,泡沫的控制，可以采用三种途径：, 调整培养基中的成分,(,如少加或缓加易起泡的原材料,),或改变某些物理化学参数,(,如,pH,值、温度、通气和搅拌,),或者改变发酵工艺,(,如采用分次投料,),来控制，以减少泡沫形成的机会。但这些方法的效果有一定的限度。, 采用机械消泡或消泡剂消泡这两种方法来消除已形成的泡沫：通过化学方法，降低泡沫液膜的表面张力，使泡沫破灭；利用物理方法，使泡沫液膜的局部受力，打破液膜原来受力平衡而破裂。, 采用菌种选育的方法，筛选不产生流态泡沫的菌种，来消除起泡的内在因素,对于已形成的泡沫，工业上可以采用机械消泡和化学消泡剂消泡或两者同时使用消泡。,化学消泡,这是利用外界加入消泡剂，使泡沫破裂的方法。消泡剂都是表面活性剂，具有较低的表面张力，或者是降低泡沫液膜的机械强度，或者是降低液膜的表面黏度，或者兼有两者的作用，达到破裂泡沫的目的。,破泡剂与抑泡剂的区别,（,1,）消泡剂可分为破泡剂和抑泡剂,破泡剂：是加到已形成的泡沫中，使泡沫破灭的添加剂。如低级醇、天然油脂。一般来说，破泡剂都是其分子的亲液端与起泡液亲和性较强，在起泡液中分散较快的物质。这类消泡剂随着时间的延续，迅速降低效率，并且当温度上升时，因溶解度增加，消泡效率会下降。,抑泡剂：是发泡前预先添加而阻止发泡的添加剂。聚醚及有机硅等属于抑泡剂。一般是分子与气泡液亲和性很弱的难溶或不溶的液体。,（,2,）作用机理上的区别,破泡剂的破泡机理大致有二种。,第一，吸附助泡剂，加入电解质，瓦解双电层，及使助泡物被增溶等机理，这样就破坏助泡物的稳泡作用。在这些过程中消泡剂发挥一次消泡作用就被消耗。同时消耗掉相应的助泡物。,第二，低级醇等溶解性较大的消泡剂，加到气泡液中局部降低表面张力，发挥破泡作用，同时本身不断破为碎块，陆续溶解而失去破泡作用。破泡过程中，破泡剂不断失效、消耗，而助泡剂却不受影响,抑泡机理：一般认为抑泡剂分子在气液界面上优先被吸附，它比助泡剂的表面活性更强，更易吸附到泡膜上，但是由于本身不赋予泡膜弹性，所以不具备稳泡作用。这样当液体中产生泡沫时，抑泡剂首先占据泡膜，抑制了助泡剂的作用，抑制了气泡。,（,3,）破泡剂与抑泡剂的相互关系,溶解度大的破泡剂，消泡作用只发挥一次；溶解度小的破泡剂，消泡作用可持续一段时间。如果溶解度进一步降低，即成为抑泡剂。另一方面，破泡剂大量使用，比有抑泡作用，抑泡剂大量使用也比有破泡作用。,1,）消泡剂选用依据：,表面活性剂，具有较低的表面张力（内聚力弱），消泡效果明显。,对气,-,液界面的散布系数必须足够大，才能迅速消泡；,无毒害性，且不影响发酵菌体；,不会在使用、运输中引起任何危害；,不干扰各种测量仪表的使用；,在水中的溶解度较小，以保持持久的消泡性能；,应该在低浓度时具有消泡活性；,应该对产物的提取不产生任何影响；,应该对氧传递不产生影响；,能耐高温灭菌。,来源方便，使用成本低；,常用的一些消泡剂：,天然油脂；,高碳醇、脂肪酸和酯类；,聚醚类；,硅酮类；,（,1,）天然油脂,最早消泡剂，来源容易，价格低，使用简单，一般来说没有明显副作用，如豆油、菜油、鱼油等。,分子中无亲水基团，在发酵液中难铺展，所以消泡活性差，用量大，一般为发酵液的,0.1-0.2%,。,近年来出于对环境保护的重视，天然产物消泡剂的地位又有些提高，而且还在研究新的天然消泡剂。,油的质量、新鲜程度：油新鲜，消泡能力强，副作用也小；,在甘油分子上加成聚合环氧丙烷的产物叫聚氧丙烯甘油定名为,GP,型消泡剂；,GP,：亲水性差，在发泡介质中的溶解度小，适用于稀薄发酵液。其抑泡性能比消泡性能好，适宜用于基础培养基中抑制泡沫的产生。如用于链霉素的基础培养基中，抑泡效果明显，可全部代替食用油，也未发现不良影响，消泡效力一般相当于豆油的,60,80,倍。,（,2,）聚醚类消泡剂,在,GP,型消泡剂的聚丙二醇链节末端再加成环氧乙烷，成为链端是亲水基的聚氧乙烯氧丙烯甘油，也叫,GPE,型消泡剂（泡敌）。按照环氧乙烷加成量为,10%,，,20%,，,50%,分别称为,GPE10,，,GPE20,，,GPE50,。,GPE,：亲水性好，在发泡介质中易铺展，消泡能力强，作用快，溶解度大，所以消泡活性维持时间短，适用于黏稠发酵液。用于四环类抗生素发酵中消泡效果很好，用量为,0.03,0.035,，消泡能力一般相当于豆油的,10,20,倍。,GPES,型消泡剂：新的聚醚类消泡剂，在,GPE,型消泡剂链端用疏水基硬脂酸酯封头，便形成两端是疏水链，当中间隔有亲水链的嵌段共聚物。这种结构的分子易于平卧状聚集在气液界面，因而表面活性强，消泡效率高。,应结合具体产品发酵，试验上述各种消泡剂的消泡效果，以获得良好的消泡作用。,值得注意的是：消泡剂有选择性。消泡剂用多了有毒性，而且还影响通气和气体分散，因此要少量地加。,消泡的效果,消泡剂：种类、性质、分子量大小、消泡剂亲油亲水基,使用方法：加入方法、使用浓度、温度等,机械消泡,化学消泡最显著的缺点是影响氧气的溶解，使其减少,1/3,1/5,，这对微生物供氧极为不利；机械消泡能克服这一缺点，但其应用效果不如化学消泡迅速可靠，不能从根本上消除引起稳定泡沫的因素。,消泡装置设计依据：,动力小；结构简单；易清洁；运行可靠；维护费用低；,机械消泡,物理学原理；可在罐内或罐外进行。,机械消泡的特点,优点：不需外加物质；节省原材料；减少污染机会。,缺点：不能从根本上消除引起泡沫稳定的原因。,方法,罐外,旋转叶片式,喷雾式,离心式,转向板式,罐内,耙式,旋转圆盘式,流体吹入式,冲击反射板式,碟片式,超声波,第七节 补料的控制,补料分批发酵,(fed-batch culture,，,FBC),：,又称半连续培养或半连续发酵，是指在分批发酵过程中，间歇或连续地补加一种或多种成分的新鲜培养基的培养方法，是分批发酵和连续发酵之间的一种过渡培养方式，是一种控制发酵的好方法，现已广泛用于发酵工业。,1 FBC,的作用,1,） 可以控制抑制性底物的浓度,高浓度营养物抑制微生物生长：, 基质过浓使渗透压过高，细胞因脱水而死亡；, 高浓度基质能使微生物细胞热致死,(,themal,death),，如乙醇浓度达,10,时，就可使酵母细胞热致死；, 有的是因某种或某些基质对代谢关键酶或细胞组分产生抑制作用，如高浓度苯酚,(3,5,),可凝固蛋白；, 高浓度基质还会改变菌体的生化代谢而影响生长等。,有的基质是合成产物必需的前体物质，浓度过高，就会影响菌体代谢或产生毒性，使产物产量降低。如苯乙酸、丙醇,(,或丙酸,),分别是青霉素、红霉素的前体物质，浓度过大，就会产生毒性，使抗生素产量减少。,有的底物溶解度小，达不到应有的浓度而影响转化率。如甾类化合物转化中，因它们的溶解度小，使基质的浓度低，造成转化率不高。,采用,FBC,方式，可以控制适当的基质浓度，解除抑制作用，得到高浓度的产物。,2,） 解除或减弱分解代谢物的阻遏,有些合成酶受到迅速利用的碳源或氮源的阻遏，如葡萄糖阻抑纤维素酶、赤霉素、青霉素等多种酶或产物的合成。通过补料来限制基质葡萄糖的浓度，就可解除酶或其产物的阻遏，提高产物产量。,3,）可以使发酵过程最佳化,分批发酵动力学的研究，阐明了各个参数之间的相互关系。利用,FBC,技术，就可以使菌种保持在最大生产力的状态。,随着,FBC,补料方式的不断改进，为发酵过程的优化和反馈控制奠定了基础。,随着计算机、传感器等的发展和应用，已有可能用离线方式计算或用模拟复杂的数学模型在线方式实现最优化控制。,FBC,的优点：,解除底物抑制、产物反馈抑制和分解代谢物的阻遏；, 避免一次投料过多造成细胞大量生长所引起的一切影响，改善发酵液流变学性质；, 可提高发芽孢子的比例，控制细胞质量；, 不需要严格的无菌条件，产生菌不易老化变异，比连续发酵适用广泛。,2,补料内容,能源和碳源；,氮源；,微量元素；,诱导物；,3,补料的原则,原则,：根据菌体生长代谢规律；,生产需要；,环境条件,方法：充足而不过量（少量多次或分批流加）,间接方法：以溶氧、,pH,值、呼吸商、排气中,CO2,分压及代谢产物浓度等作为控制参数。对间接方法来说，选择与过程直接相关的可检参数作为控制指标，是研究的关键。通气发酵利用排气中,CO2,含量作为,FBC,反馈控制参数是较为常用的间接方法。,直接法：随着一系列技术障碍的克服，该法将会得到迅速普及。反馈控制的,FBC,，常常是依据个别指标来进行，在许多情况下，并不能奏效，尚需进行多因子分析。,4,补料的控制,FBC,还可采用“放料和补料”,(withdraw and fill),方法：发酵一定时间，产生了代谢产物后，定时放出一部分发酵液,(,可供提炼,),，同时补充一部分新鲜营养液，并重复进行。,维持一定菌体生长速率，延长发酵产物生产期，有利于提高产物产量，降低成本。注意染菌。,注意事项：,适宜料液比,无菌操作,碳氮平衡，经济合理,第八节 高密度发酵,高密度发酵：,应用一定的培养技术和设备来提高菌体生物量和目标产物产率的发酵技术。,一般认为，细胞密度接近理论值的培养为高密度发酵。,提高发酵罐内菌体密度；提高产物细胞水平量；,减少生物反应器体积；提高单位体积设备生产能力；,降低生物量分离费用；降低成本；提高生产效率。,一、高密度发酵策略,（,1,）使用最低合成培养基；,（,2,）充分利用碳源；,（,3,）碳源作为限制性养分。,二、影响高密度发酵的因素,（,1,）培养基：,如碳源与氮源的比例小，会导致菌体生长旺盛，造成菌体提前衰老自溶；比例偏大，菌体数量少，细胞代谢不平衡，不利于产物积累。,微量元素和无机盐对细菌的生长繁殖和外源蛋白的表达有很大影响。,（,2,）溶氧,随着发酵时间的延长，菌体密度迅速增加，溶氧浓度随之降低，细胞生长减慢，特别是后期，由于菌体密度扩增，耗氧量极大，氧气供给严重不足，从而导致菌体生长及其缓慢。,（,3,）温度,培养温度随菌种、培养基成分和细胞生长阶段的不同而不同，温度不仅影响发酵液的理化性质，还对外源蛋白的表达和活性有很大影响。,细胞密度较高时，呼吸作用释放大量热量导致发酵液温度升高。因此需要快速有效的降温散热系统。,（,4,）,pH,在发酵过程中需防止有机酸的大量积累而影响菌体的生长和外源蛋白的表达。,（,5,）副产物,应避免有毒副产物对菌体及产物的不利作用。,三、高密度发酵存在问题,（,1,）基质对菌体生长的抑制作用；,（,2,）基质与产物的不稳定性；,（,3,）产物或副产物累积对菌体的抑制；,（,4,）高浓度的,CO,2,与热的释放速率；,（,5,）高氧需求及培养基黏度不断增加。,四、解决手段,1,改进发酵条件,（,1,）选择合适的培养基,（,2,）建立流加式培养,（,3,）提高供氧能力,2,构建产副产物少的工程菌,第九节 发酵终点的判断,生产能力（或称生产率、产率）是指单位时间内单位罐体积发酵液的产物积累量而言。,生产率单位一般为,g,(,Lh,),或,kg,(m,3,h),，产物浓度单位为,g,L,或,kg,m,3,，发酵时间单位为,h,。,高生产率,+,成本控制,产物形成过程：生长,发酵,衰老,到了衰亡期，菌体的产物分泌能力都要下降，产物的生产率相应下降或停止。有的产生菌在衰亡期，营养耗尽，菌体衰老而进入自溶，释放出体内的分解酶会破坏已形成的产物。,发酵终点的判断原则,根据发酵类型，生产目标，判断发酵终点。,对发酵及原材料成本占整个生产成本主要部分的发酵品种，主要追求提高生产率,(kg/m,3,h),，得率,(kg,产物,/kg,基质,),和发酵系数,(kg,产物,/,罐容积,m,3,发酵周期,h),下游提取精制成本占主要部分和产品价格比较贵，除了要求高的产率和发酵系数外，还要求高的产物浓度。,合理的放罐时间是由实验来确定的，即根据不同的发酵时间所得的产物产量计算出发酵罐的生产率和产品成本，采用生产率高而成本又低的时间，作为放罐时间。确定合理放罐时间，需考虑下列几个因素：,一、经济因素,以最低的成本来获得最大生产率的时间为最适发酵时间。,缩短发酵周期，设备的利用率提高，但单位体积发酵液的产物产量增长有限,延长时间，平均生产率下降，而动力消耗、管理费用支出、设备消耗等费用仍在增加，因而产物成本增加。,二、产品质量因素,发酵时间太短，残留过多尚未代谢的营养物质，不利于提取、分离。,发酵时间太长，菌体自溶，释放出菌体蛋白或体内的酶，改变发酵液性质，增加过滤难度，延长过滤时间，破坏一些不稳定产物。,太长或太短均会使产物质量下降，含量增加。,三、特殊因素,异常情况：染菌、代谢异常,(,糖耗缓慢等,),避免损失，挽救。,判断放罐指标：产物浓度、过滤速度、氨基氮、菌丝形态，,pH,、培养液的外观、粘度,菌体自溶前的迹象：,氨基氮升高、,pH,升高、菌丝碎片增多、粘度增大、过滤速度降低,放罐临近时，加糖、补料或消泡剂都要慎重，因残留物对提取有影响。补料可根据糖耗速率计算到放罐时允许的残留量来控制。,思考题,根据微生物对温度的依赖可分类成哪几类微生物？,发酵热的定义,生物热的大小与哪些因素有关？,温度对发酵有哪些影响？,发酵过程温度的选择有什么依据？,pH,对发酵的影响表现在哪些方面？,为了确定发酵的最佳,pH,我们该如何实验？,发酵过程的,pH,控制可以采取哪些措施？,发酵中泡沫形成的原因是什么？对消泡剂有哪些要求？,常用的消泡剂有哪几类？,FBC,的优点与作用？,基质浓度对发酵有何影响？如何进行控制？,排气中二氧化碳控制的意义是什么？,发酵过程主要分析项目有哪些？,