呼吸道病原体检测

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,呼吸道病原体检测,陆欢平,呼吸道感染,呼吸道感染是指病原体感染人体的鼻腔、咽喉、气管和支气管等呼吸系统,分为上呼吸道感染和下呼吸道感染,上呼吸道感染,常见急性上呼吸道感染，指鼻腔、咽或喉部急性炎症的概称，是呼吸道最常见的一种传染病,常见病因为病毒，少数由细菌引起。患者不分年龄、性别、职业和地区。不仅具有较强的传染性，而且可引起严重并发症,下呼吸道感染,包括急性气管,/,支气管炎、慢性支气管炎、肺炎、支气管扩张等,由病毒、细菌、支原体、衣原体、军团菌等微生物引起，其防治应遵循预防为主、准确诊断、及时治疗的原则，治疗时必须明确引起感染的,病原体以选择有效的抗生素,呼吸道病,原体,常见的呼吸道病原体主要有病毒、细菌、支原体、衣原体和立克次体等,据统计，,90%以上急性呼吸道感染由病毒引起,一种病原体可引起多种临床症状，同一临床表现可由多种病原体引起,呼吸道病原体,细菌：细菌引起呼吸道感染的机会比病毒少。一旦感染，症状多较严重，定位比较明显，如扁桃体炎、中耳炎、鼻窦炎等。由细菌引起的儿童肺炎往往是流感嗜血杆菌、肺炎链球菌或金黄色葡萄球菌,呼吸道病原体,病毒，包括鼻病毒、冠病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒、腺病毒等,呼吸道病原体,支原体、衣原体感染导致的呼吸道感染与其它病原体感染的早期临床表现类似。可能在2-3天后咳嗽的症状会表现比较突出。在小于30岁的年轻人中，肺炎支原体是最重要的下呼吸道病原体,非典型呼吸道病原体,是指除肺炎链球菌以外的病原体，包括嗜肺军团菌(LP)、肺炎支原体(MP) 、肺炎衣原体(CP) 、Q热立克次体(贝纳柯克斯体) 、腺病毒(ADV) 、呼吸道合胞病毒(RSV) 、流感病毒(IFV)和副流感病毒(PIV)等,非典型呼吸道病原体,这些病原体变异快，传播广，由于不易形成长期免疫力而难以预防和控制,流感病毒 副流感病毒病毒 呼吸道合胞病,毒,腺病毒,呼吸道病,原体检测,现有的主要方法：,病毒分离培养,抗原检测,抗体检测,分子生物学方法等,检测方法的比较,检测方法,优点,缺点,病毒分离培养,特异性高，金标准,培养条件要求高、灵敏度低，标本中病原体量少时，易致假阴性。,抗原检测,直接免疫荧光法,简便、快速、灵敏度和特异性均较高,且可用于疾病的早期诊断,需要特异性抗体、荧光显微镜，易受采样限制,抗体检测,间接免疫荧光法,灵敏度、特异性较高,对疾病早期诊断没有太大帮助,酶联免疫吸附法,较快速,，批量筛查,特异性不高，假阳性多,分子生物学方法,灵敏度和特异性均很高,操作繁琐，价格昂贵,抗体,、抗原检测的比较,抗体,IgM检测,病原体抗原检测,检测最佳时间,一般在感染一周左右,病毒感染出现症状后即可检测出,临床意义,回顾性诊断,，,适用于疾病,中后期的诊断，,可用于疾病早期诊断,，,对患者的治疗有重要指导意义,检测灵敏度,将包被有不同基质的生物薄片固定在一个反应区中，可同时检测多种抗不同病原体的抗体,检测方法,一般使用,ELISA或者间接免疫荧光法，有非特异性荧光,一般使用直接免疫荧光法，几乎没有非特异性反应,，敏感性较差,IgM,IgG,机体产生,IgM一般需要一周左右的时间，而有免疫缺陷或免疫系统不健全的个体如儿童，特别是3岁以下的小孩，其产生抗体往往需要更久，且抗体产生的水平也较低,若检测的是IgG，则不能很好地区分既往感染和急性感染,因此，抗原检测的方法对婴幼儿和儿童的呼吸道感染的病因诊断、鉴别诊断和临床用药指导比抗体法更有优势,检测抗体,IgM,比,IgG,更有临床意义,采样,抗原检测,拭子伸入鼻部后向鼻咽部水平伸入，不是向鼻腔伸入。伸入距离为从耳垂部到鼻尖长度的一半，一般针对两周岁以下儿童，伸入距离约为拭子绒毛头的长度两倍,拭子伸入后要轻轻捻动拭子转,3,圈。取样后在一小时之内洗脱到生理盐水中，,12,小时内送检,抗原检测采样,采样,抗体检测,采样对结果影响较大,非典型感染多为干咳，无痰/少痰,阳性率低（标本问题，病毒颗粒小）,抗原在体内存在时间短,抗原检测的劣势,九项呼吸道感染病原体,IgM,抗体检测,检测原理,间接免疫荧光法（,IFA,）是基于待测样本中的抗体与吸附在载玻片上的抗原发生的反应。样本中存在的特异性抗体和抗原反应，未与抗原结合的免疫球蛋白在洗涤步骤中除去。在下一步骤中，抗原,-抗体复合物与荧光素标记的抗人球蛋白反应，用免疫荧光显微镜观察结果,试剂盒组成,组分,成分和用途,载玻片,检测的物理载体，覆有聚四氟乙烯并包被有针对检测物的特异性抗原，,质控品,吸附剂,羊抗人,IgG用来吸附人IgG避免干扰IgM 检测,FITC,结合物,荧光素标记的抗人免疫球蛋白结合物，和抗原抗体复合物反应，并显色,封闭介质,甘油缓冲液，便于观察,磷酸盐缓冲液,(PBS),用于洗涤步骤，从反应介质中除去未结合的免疫球蛋白和结合物,实验步骤,1,样本的稀释：血清标本与PBS按1:1比例稀释,稀释后的血清加入吸附剂中，彻底混匀。处理后的血清要离心10-15分钟除去沉淀，以防干扰检测,实验步骤,2,结果判断,阴性结果荧光图谱,军团菌、肺炎衣原体和立克次体无荧光；支原体、腺病毒、甲型和乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的细胞呈现红色,阳性结果荧光图谱,腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒或副流感病毒对阳性血清的,1-15%,细胞的细胞核、胞浆或胞膜出现苹果绿色荧光；军团菌、衣原体或立克次体中所有的细菌呈现出苹果绿色荧光；支原体对阳性血清在细胞外围呈现苹果绿色荧光,病原体,形态或荧光模式,嗜肺军团菌,杆状,肺炎支原体,细胞外围荧光模式,立克次体,球杆状,肺炎衣原体,球状,腺病毒,混合荧光模式（细胞核和胞浆或胞膜）,呼吸道合胞病毒,混合荧光模式（细胞核和胞浆或胞膜）,甲型流感病毒,混合荧光模式（细胞核和胞浆或胞膜）,乙型流感病毒,混合荧光模式（细胞核和胞浆或胞膜）,副流感病毒,混合荧光模式（细胞核和胞浆或胞膜）,嗜肺军团菌,阴性：荧光弱、少、不规则,嗜肺军团菌,阳性：荧光密集，且亮度较好，杆状形态,肺炎支原体,阴性：红色细胞周围无或少量荧光，亮度弱,肺炎支原体,阳性：荧光占视野,50%,以上，亮度好，形态为明显的细胞膜或胞浆,Q,热立克次体,阴性：荧光弱、少、不规则,Q,热立克次体,阳性：荧光亮度强且数量多，形态典型,肺炎衣原体,阴性：荧光弱、少,肺炎衣原体,阳性：荧光密集，且亮度较好,腺病毒,阴性：荧光弱、少,腺病毒,阳性：荧光亮度强且数量多，平均每个视野的阳性细胞,3-5,个,呼吸道合胞病毒,阴性：荧光弱、少,呼吸道合胞病毒,阳性：荧光亮度强且数量多，平均每个视野的阳性细胞,3-5,个,甲型流感病毒,阴性：荧光弱、少,甲型流感病毒,阳性：荧光亮度强且数量多，平均每个视野的阳性细胞,3-5,个,乙型流感病毒,阴性：荧光弱、少,乙型流感病毒,阳性：荧光亮度强且数量多，平均每个视野的阳性细胞,3-5,个,副流感病毒,阴性：荧光弱、少,副流感病毒,阳性：荧光亮度强且数量多，平均每个视野的阳性细胞,3-5,个,方法的局限性,抗体水平无显著上升时不能排除感染的可能性,单一样本抗体检测结果不能帮助作出近期感染的诊断。应采集双份样本（急性期和康复期）同时检测来观察血清转化或抗体水平的明显升高,方法的局限性,对患有自身免疫性疾病病人的血清，用,IFA检测时，支原体、腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒，会在细胞上发生非特异性反应，这些血清不能用,此方法评价,质控孔用于检测这种现象,方法的局限性,在嗜肺军团菌和,Q热立克次体中，有时血清会含有与卵抗原反应的抗体，所以使用卵黄囊固定抗原会出现非特异性荧光。当出现这种情况时，该血清就不能用IFA进行分析了,临床实际效果图,九联检,思考题,质控孔的作用是什么？,谢谢！,