生物素-亲合素放大技术

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Dr.Yao Jun,Faculty of Laboratory Medicine in Taizhou College,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,生物素亲和素免疫放大技术,培训人：马秀玲,概述：,70,年代后期在免疫酶技术中利用生物素,-,亲和素系统,(Biotin-Avidin System BAS),标记抗体发展了又一种新型生物反应放大技术,。,主要内容,生物素理化性质与标记,亲和素、链霉亲和素的理化性质与标记,生物素,-,亲和素的特点、基本类型及原理,生物素,-,亲和素系统的应用,维生素,H,动、植物组织中广泛,分布,卵黄和肝含量高,MW 244.31kD,I,咪唑酮环,噻吩环,羧基,第一,部分,生物素理化性质与标记,生物素（Biotin)有两个环状结构,I环（咪唑酮环）为与亲和素结合的主要部位,II环（噻吩环）为结合抗体和其它生物大分子的部位，C2上戊酸侧链的未端羧基是结合生物大分子的唯一结构,一、活化生物素,生物素侧链的末,端,羧基,经化学修,饰后制成带各种,活性基团的衍生,物,活化生物素,(,生物素化衍生物,),II,环为噻吩环，其末端羧基是结合抗体和其他,生物大分子的惟一结构，经化学修饰后成为活化生物素,生物素活化,活化生物素,易,与抗原、抗体,酶及核酸分子,中相应基团偶,联形成,生物素,化标记物,标记蛋白质,氨基,的活化生物素,标记蛋白质,醛基,的活化生物素,标记蛋白质,巯基,的活化生物素,标记,核酸,的活化生物素,活化生物素,标记蛋白质氨基的活化生物素,BNHS,分子可与蛋白质赖,氨酸的氨基形成肽键,BNHS,适用标记,抗体,和,中性或偏碱性的蛋白质,生物素,N-,羟基丁二酰胺,碳二亚胺,生物素N-,羟基丁二,酰亚胺酯,（BNHS）,如何减小空间位阻？,长臂活化生物素,（BCNHS）：,生物素和N-羟基丁二酰亚胺之间添,加了两个,6-氨基已糖,分子基团，形,成连结臂，以减少位阻效应的影响,长臂活化生物素(,BCNHS),是在生物素和,N-,羟,基丁二,酰,亚,胺,之间添加了两个 6-氨基己糖分子基团,，,形成连结臂,，,使其与抗体、酶等生物大分子结合后,，,不受位阻效应的影响,更易发挥生物素的活性作用,标记蛋白质醛基的活化生物素,生物素酰肼(,BHZ,)：水合肼与生物素的合成物,主要用于标记,偏酸,性糖蛋白(Ag),肼化生物胞素(BCHZ)：生物素与赖氨酸连接,后，再与无水肼反应而成。除醛基外，,BCHZ还可标记氨基,标记蛋白质巯基的活化生物素,马来酰亚胺,-,丙酰,-,生物胞素（,MPB),能特异地与,蛋白质巯基,结合的活化生物素,标记核酸的活化生物素,光生物素(photobiotin),侧链上连接的芳香基叠氮物基团,经光照后,变为芳香基硝基苯，可直接与腺嘌呤氨基结合,形成B（生物素）-,核酸,探针,生物素脱氧核苷三磷酸,（Bio-dUTP）,作为TTP（三磷酸胸苷）的结构类似物，可,采用缺口移位法掺入到双链DNA中。,BNHS和BHZ,可直接标记核酸，,但对碱基配对有影,响（影响氢键的形成）,活化生物素通过侧链与蛋白分子连接,一个蛋白分子可被多个生物素标记多价性,对BNHS多标记抗体,BHZ则多标记偏酸性抗原；抗原、抗体标记后活性不变,可对标记材料（如酶）标记：碱性磷酸酶标记后活性将降低,二、,生物素标记蛋白质,选择活化生物素：,依抗原或抗体分子所带可标记基团的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的酸碱性,控制生物素,:,蛋白质比例,生物素,:IgG,用量比,(mg/mg),宜为,2:1,IgG,应用浓度,0.5,5,g/ml,1,3,个生物素,/1,个,Ag,，,3,5,个生物素,/1,个,Ab,使用,交联臂,减少空间阻力,亲合素,(avidin,AV),和链霉亲合素,(streptavidin,SA),是生物素的天然特异性结合物,二者均为大分子蛋白，因此几乎所有用于标记的物质均可以同亲合素（,AV,）或链酶亲合素（,SA,）结合,第二部分,亲合素、链霉亲合素的理化性质与标记,亲和素（,Avidin),耐热并耐受多种蛋白水解酶的作用，与生物素,结合后稳定性更好。每个亲和素能结合四个分子的生物素,亲合素(Avidin,AV),生物素（Biotin,B）,结构 四亚基糖蛋白 四肽链蛋白 无糖基,pI 10.5 6,结合位 色氨酸 色氨酸,生物素 4 4,K（亲和常数）10,15,10,15,活性(U)13,15 15,18,亲合素（,A,）,链霉亲合素,(SA),一、理 化 特 性,二、亲合素,/,链霉亲合素标记,标记物：酶、胶体金,异硫氰酸荧光素（FITC）,HRP-AV(SA),改良过碘酸钠法、戊二醛法,ABC/SABC,预制亲和素(AV)-Biotin、,链霉亲和素(SAV)-Biotin,第三,部分,生物素,-,亲合素系统的特点,、基本类型及原理,一、特点,:,灵敏度,特异性,稳定性,适用性,其他,灵敏度高,其反应呈高度专一性,稳定性高,适用范围广,实验成本低,二,、,生物素,-,亲合素系统基本类型及原理,BAB法（亲和素-标记生物素法）：,特点：以游离亲和素为桥臂，分别连接生物素化抗原（或抗体）和标记生物素（如酶标生物素）,返回,+A,+A,亲和素-标记生物素法（BAB法）：先使抗原与生物素（B）化的抗体结合，再以游离亲合素(A)将生物素化的抗体与酶标生物素搭桥连接，也达到多层放大效果,亲合素(A),生物素化的抗体,酶标生物素,底物,BA法（标记亲和素-生物素法）,特点：以标记亲和素/标记链霉亲和素（A-E/SA-E）代替BAB法中的游离亲和素（A），省却了加标记生物素（B-E）的步骤,BAB法（亲和素-标记生物素法）：,特点：以游离亲和素为桥臂，分别连接生物素化抗原（或抗体）和标记生物素（如酶标生物素）,+A-E,BA法（标记亲和素-生物素法）：以标记亲和素/标记链霉亲和素（A-E/SA-E）代替BAB法中的亲和素（A），省却了加标记生物素（B-E）的步骤,A-E,+,B-E +,A,ABC,ABC法,特点:将BAB法中的,A（亲和素）,先与B-E（酶标生物素）结合，制备成复合物ABC（亲和素-生物素-过氧化酶复合物）,ABC,法,原理示意图,特点：将,BAB,法中的,A,（亲和素）先与,B-E,（酶标生物素）结合，制备成复合物,ABC,+,ABC,Ab-Ag-Ab-B+ABC Ab-Ag-Ab-B-ABC,预先按一定比例将亲和素（或链霉亲和素）与酶标生物素结合，形成可溶性的,亲和素（或链霉亲和素）-生物素-过氧化物酶复合物（ABC或SABC）,。当其与检测反应体系中的生物素化抗体（直接法）或生物素化第二抗体（间接法）相遇时，ABC（或SABC）复合物中未饱和的亲和素（或链霉亲和素）结合部位即可与抗体上的生物素结合，使抗原-抗体反应体系与ABC（或SABC）标记体系连成一体进行检测,第四,部分,生物素,-,亲合素系统的应用,生物素与亲合素之间结合的,亲合力高、特异性强,生物素与亲合素各自均可以与各型大小分子结合，以及二者在结合反应时具有的,多级放大作用,等优越性,使,BAS,及其相关技术被广泛应用在各种,标记免疫分析技术,领域中，尤其为标记免疫检测自动化分析做出了极大的贡献,方法应用,BSA,在酶免疫测定中的应用,BSA,在荧光免疫技术中的应用,BSA,在放射免疫测定中的应用,BSA,在分子生物学中的应用,一,、生物素,-,亲合素系统在酶免疫测定中的应用,BAS,在,ELISA,中的应用,生物素,-,亲合素系统在均相酶免疫测定,BAB-ELISA,夹心法测抗原的原理：用,生物素化的抗体,替代常规,ELISA,中的酶标抗体，与已与固相抗体结合的抗原抗体复合物结合，然后连接亲和素及酶标生物素，从而使反应信号放大，提高检测灵敏度,二,、生物素,-,亲合素系统在荧光免疫技术中的应用,BAS,用于荧光抗体技术,通常采用,BA,法，即用荧光素直接标记亲合素（或链酶亲合素）,游离亲合素（或链酶亲合素）搭桥，两端分别连接生物素化抗体和荧光素标记的生物素（,BAB,法）,荧光标记的抗亲合素（或链酶亲合素）抗体的夹心法,三,、生物素,-,亲合素系统在放射免疫测定中的应用,BAS,主要与免疫放射分析,(IRMA),检测体系偶联，用于对终反应的放大（,BA,法）,BAS,也可用于,IRMA,反应后,B,、,F,成分的分离,四,、生物素,-,亲合素系统在分子生物学中的应用,以,生物素标记核酸探针,进行的定位检测,用,BAS,制备的亲和吸附剂进行基因的分离纯化,将免疫测定技术与,PCR,结合建立免疫,-PCR(immuno-PCR),用于抗原的检测,。,-,报告结束,请各位专家提出宝贵意见,