细胞培养技术和培养箱

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第十章 细胞培养技术和培养箱,cell culture and incubate,教学基本要求,1,2,3,掌握细胞培养概念、细胞培养箱分类、基本原理和基本结构。,熟悉细胞培养技术。,了解细胞培养箱常见故障处理及仪器的进展,本章目录,第一节,细胞培养技术的基本原理,第二节,培养细胞的类型、特点及增殖过程,第三节,培养细胞的生存条件及技术方法,第四节,培养箱的分类、结构、使用及维护保养,第五节,培养箱的进展,第一节 细胞培养技术的基本原理,细胞培养（,cell culture,）,也称为组织培养（,tissue culture,），,是从生物体内取出组织或细胞，在试管和培养平皿内模拟体内生理环境，于无菌、适当温度和一定营养条件下，对这些组织或细胞进行孵育培养，使之保持一定的结构和功能，以便于我们观察研究。,第二节 培养细胞的类型、特点及增殖过程,根据体外培养细胞能否贴附在支持物上生长的特性，可分为,贴附型,和,悬浮型,两大类。大多数培养细胞为贴附型，多呈上皮样或成纤维细胞样，具有接触抑制和密度抑制的特性。少数细胞在培养时以悬浮状态生长（包括一些取自血、脾或骨髓的培养细胞，尤其是血液白细胞，以及一些肿瘤细胞）。,第二节 培养细胞的类型、特点及增殖过程,贴附细胞型,MRC-5,成纤维细胞,第二节 培养细胞的类型、特点及增殖过程,贴附型细胞正常猴肾单层上皮细胞,Molt4,细胞悬浮,2,3,天的细胞图片,(,成人,T,淋巴细胞白血病细胞株,),第二节 培养细胞的类型、特点及增殖过程,第二节 培养细胞的类型、特点及增殖过程,悬浮型培养细胞,第二节 培养细胞的类型、特点及增殖过程,传代（,passage,或,subculture,）,当细胞增殖至一定密度后，由于培养细胞的孤立生存环境和有限的营养，则需分离出一部分细胞接种到其他容器，并及时更新培养液，使细胞增殖继续过程。,一,代,从细胞接种到下一次传代再培养的一段时间。细胞培养一代的过程中，一般细胞可,倍增,2,6,次。,第二节 培养细胞的类型、特点及增殖过程,原代细胞培养,从供体取得组织，分离得到所需细胞后接种于培养瓶，进行首次培养。,次代细胞培养,将原代细胞培养物用胰酶和,EDTA,消化处理后，收集洗涤，再分装至含有新鲜营养液的培养瓶中继续培养，形成的单层细胞。,第二节 培养细胞的类型、特点及增殖过程,细胞系（,cell line,）,原代细胞一经传代后细胞。,无限细胞系或连续细胞系,细胞获得永生性即永久增殖的能力。,培养细胞的生存条件,培养皿,或培养瓶,温度、湿度和气体,由,CO2,恒温孵育箱提供,生长,培养液,10,20,的血清,维持,培养液,2,5,的血清,营养物质,糖、氨基酸、维生素、无机离子、微量元素等,第三节 培养细胞的生存条件及技术方法,培养设备,第三节 培养细胞的生存条件及技术方法,技术方法,细胞分离,原代（初代）培养,消化法传代,组织块剪切,消化法使组织进一步分散,制备,获得细胞悬液计数后，加入营养液稀释成一定浓度细胞悬液孵箱中进行培养,细胞悬液计数后，加入营养液稀释成一定浓度细胞悬液孵箱中进行培养,将原代细胞培养物用胰酶和,EDTA,消化处理后，收集,洗涤，,再分装至 含有新鲜营养液的培养瓶中继续培养,第三节 培养细胞的生存条件及技术方法,第三节 培养细胞的生存条件及技术方法,冻存,选用,对数生长期,细胞，用常规方法收集按（,1,5,）,10,6,/ml,细胞浓度，悬浮于,含,10,DMSO,或甘油的,含血清培养液中，分装，封口，放入纱布小袋中。可用手工方法从把冻存管悬在,液氮容器口开始,，在,30,40min,时间内，下降到液氮表面，再停,30min,后，直接投入液氮中。或先将冻存管移入,液氮罐口颈部气相中过夜,，次日将纱布袋缓慢下降至液氮中，历时,3min,。在液氮中可长期保存。,复苏,将冻存于液氮中的冻存管取出，,迅速放入,37 ,40,水浴,中使其在,1min,内融化。在无菌条件下打开冻存管，取出细胞悬液至离心管中，补加,10ml,培养液，,500,1000rpm,低速离心,5min,，去上清,，加入新鲜培养液适量，转入培养瓶中置,37,培养。,细胞的冻存和复苏,-“,慢冻快融”,第三节 培养细胞的生存条件及技术方法,霉菌污染,后，一般肉眼可见在培养液中形成白色或浅黄色飘浮物，短期内培养液多不混浊；倒置显,微镜下可见于细胞之间悬浮飘荡在培养液中的纵横交错穿行的丝状、管状及树枝状菌丝，,很多菌丝在高倍镜下可见到有链状排列的菌珠；,或可见散在细胞周边和细胞之间的卵圆形单细胞真菌,。,细胞培养微生物污染的检测,第三节 培养细胞的生存条件及技术方法,细菌污染后，由于大量酸性物质产生，,培养液短期内颜色变黄并出现明显混浊现象,；倒置显微镜下观察，可见培养液中有大量细小的圆球状颗粒飘浮，有时在细胞表面和周围有大量细菌存在，细胞生长停止并有中毒表现。,支,原体污染可做如下检测：相差显微镜检测， 将细胞接种于事先放置于培养瓶内的盖玻片上，,24h,后取出，用相差油镜观察，支原体呈暗色微小颗粒位于细胞表面和细胞之间；,荧光染色法，用能与,DNA,特异性结合的荧光染料,Hoechst 33258,使支原体,DNA,着色，置荧光显微镜下观察，可见散在于细胞周围或附于细胞膜表面的亮绿色小点为支原体污染；,电镜检测，用扫描电镜或透射电镜观察支原体；,DNA,分子杂交检测或支原体培养等方法，检出率高，但方法较复杂。,细胞培养微生物污染的检测,第三节 培养细胞的生存条件及技术方法,临床肿瘤,诊断,临床病原学,诊断,基因转移,核移植,细胞融合,组织工程,细胞治疗,细胞培养应用,一、电热恒温培养箱,二、二氧化碳培养箱,三、厌氧培养箱,第,四,节,培养箱的分类、结构、使用及维护保养,第,四,节,培养箱的分类、结构、使用及维护保养,电热恒温培养箱适合于普通的细菌培养和封闭式细胞培养，并常用于有关细胞培养的器材和试剂的预温及恒定。,电热恒温培养箱,有,隔水式电热恒温培养箱和气套式电热恒温培养箱,两种，两者基本结构相似，只是加热方式不同，前者的温度变化幅度比后者小，因而在使用上更具有优势。,气套式电热恒温培养箱,电热恒温培养箱,第,四,节,培养箱的分类、结构、使用及维护保养,恒温培养箱为优质钢板制造的,立式箱体,，,内门,用钢化玻璃制成。无需打开内门观察箱内物品有利于保温。工作室由双层不锈钢亚弧焊接制成，里面一般放置,2,3,层用于承托培养物的,不锈钢搁板，,工作室和钢化玻璃内门之间装有硅橡胶密封圈，工作室外壁左、右和底部通过,隔水套,加热，工作室顶装有一只低噪声小型风机，以保证箱内温度均匀,水套上部设有溢水口直通箱体底部，并有低水位报警功能。气套式采用空气循环加热方式，,加热组件,环绕培养箱的所有外夹套，可以均匀加热。箱体外壳和工作室外壁填充硬质聚胺酯隔热。电源开关和电源指示灯、微电脑智能控温仪均设置在培养箱上部，微电脑智能控温仪采用,自整定,PID,技术,，,恒温培养箱,第,四,节,培养箱的分类、结构、使用及维护保养,恒温培养箱使用步骤,隔水层的加水,温度设定,温度显示值修正,上限跟踪报警设定,控温仪的,PID,自整定控制,电热恒温培养箱使用与注意事项,第,四,节,培养箱的分类、结构、使用及维护保养,隔水层的加水,第一次使用时，打开水龙头低水位指示灯亮且伴有报警声，当水位逐渐升高，低水位指示灯灭报警声消失时，应及时关闭水龙头。若溢水口有水溢出时,应把放水塞头拔出放水，同时观察溢水口，没有水溢出时应立即将塞头塞紧。直至低水位无声、无报警、没水溢出。,智能控温仪的温度设定,按控温仪的功能键“,SET”,进入温度设定状态，再按移位键配合加键或减键，设定结束需按功能键“,SET”,确认。设定结束后培养箱进入升温状态，加热指示灯亮。当箱内温度接近设定温度时，加热指示灯反复多次忽亮忽熄，控制进入恒温状态。,第,四,节,培养箱的分类、结构、使用及维护保养,第,四,节,培养箱的分类、结构、使用及维护保养,第,四,节,培养箱的分类、结构、使用及维护保养,二氧化碳培养箱,（培养箱）提供箱内一定浓度,二氧化碳气体和相对湿度,，创造了细胞与微生物正常生命活动的环境条件，使之在脱离复杂机体内环境的直接影响，在体外能生长繁殖。,培养箱的结构,以水套式,CO2,培养箱为例，培养箱基本有三壁结构,箱体、控制中心（包括键盘、显示器、指示器等）、,CO,2,/O,2,传感器、增湿盘等。,二氧化碳培养箱,第,四,节,培养箱的分类、结构、使用及维护保养,二氧化碳培养箱,控制中心（包括键盘、显示器、指示器等）,第,四,节,培养箱的分类、结构、使用及维护保养,可分为单,双内舱水套培养箱两种。,箱内传感器,有热传导,(T/C,）和红外（,IR,）传感器两种。,水套注入口,(,用于注满水,),。,水套排气口,（在水套注满过程中或热胀冷缩时让空气逸出，不能覆盖）。,水套水排口,（用于迅速排空水套）。,加热式内门,（为了保持箱内干燥）。,箱内气体取样口,（可使用,Fyrite,或类似工具提取箱内样本的含量）。,培养箱的分类、结构特点和使用水套式,CO2,培养箱,二氧化碳培养箱的结构,第,四,节,培养箱的分类、结构、使用及维护保养,运行模式,-,默认模式,设定模式,-,温度、超温、和浓度设置,校正,模式,-,变化系统参数直至用户满意为止，包括温度偏移、零点、,CO2,浓度范围、浓度范围、相对湿度（,RH,）偏移等,系统配置,-,允许用户设置变化的选件,（包括可听、存取代码、低温警报、高温警报、温度继电器、浓度过低警报、浓度过高警报、,RH,过低警报、,RH,继电器、,O2,浓度过低警报、浓度过高警报、继电器、显示,1,设置、显示,2,设置、补偿、,RS485,登址、气体保护器设置、门加热等）,第,四,节,培养箱的分类、结构、使用及维护保养,水套式培养箱四个基本模式设置（运行、设置、校正、系统配置）,第,四,节,培养箱的分类、结构、使用及维护保养,结构特点：,直接加热，加热组件环绕所有外夹套，能均匀加热并用玻璃纤维绝缘包绕；,箱体不需注水、排水，无溢出或缺水警报；,取样口处于箱体的前部；,与水套式相比重量减轻；,采用过温保护系统，当温度过高可自动切断电源。,气套式培养箱,第,四,节,培养箱的分类、结构、使用及维护保养,可选配,HEPA,过滤系统，箱体内气体每分钟被过滤一次，快速达到,100,级气体质量，能为细胞提供理想环境。气套式培养箱的温度范围是（室温,+5,）,50,，箱内的传感器亦分为热传导（,T/C,）传感器和红外（,IR,）传感器两种。当箱内温度和湿度相对稳定时，选用,T/C,控制；当箱内温度和湿度水平频繁波动时，选用,IR,控制。,结构特点：,第,四,节,培养箱的分类、结构、使用及维护保养,双重灭菌,功能，即,24,小时持续灭菌和不定期高温灭菌,。高温灭菌温度为,140,，可除去霉菌、酵母等各类真菌以及各类细菌。,24,小时持续灭菌是指培养箱采用的,气体,HEPA,过滤系统,。不定期高温灭菌是根据实验的需要而进行的,高温消毒,循环过程。高温消毒循环过程大约需要,12,小时，可利用夜间灭菌而不影响第二天实验的进度，通过采用最优化的温度与流程，可以减少加热对培养箱的损伤，具有高效、快速、简便的特点,。,高温灭菌培养箱,第,四,节,培养箱的分类、结构、使用及维护保养,第,四,节,培养箱的分类、结构、使用及维护保养,第,四,节,培养箱的分类、结构、使用及维护保养,第,四,节,培养箱的分类、结构、使用及维护保养,称厌氧培养系统（,Anaerobic System,），是目前国际上公认的厌氧菌培养的最佳设备。操作者可以通过培养箱前面附带的橡胶手套在箱内进行操作，使厌氧菌的接种、培养和鉴定等全部工作都在无氧的环境下进行，因而提高了厌氧菌的阳性检出率。,厌氧培养箱,第,四,节,培养箱的分类、结构、使用及维护保养,厌氧培养箱,第,四,节,培养箱的分类、结构、使用及维护保养,箱内的厌氧状态产生原理自动连续循环换气系统,第,四,节,培养箱的分类、结构、使用及维护保养,第,四,节,培养箱的分类、结构、使用及维护保养,催化除氧系统,(,厌氧菌最佳生长气体条件,85%N2,、,5%CO2,和,10%H2),箱内的厌氧状态产生原理,第,四,节,培养箱的分类、结构、使用及维护保养,大容量细胞培养箱,(,可容纳一个七层高的共可放,35,个培养瓶的细胞转瓶机,),第,四,节,培养箱的分类、结构、使用及维护保养,细胞转瓶机，水平摇床,第五节 培养箱的进展,随着集成电路、材料结构等相关技术的发展，新的制造工艺不断被应用于培养箱的制作，但价格也变得昂贵，所以不同实验室应根据各自的能力和目的，选择相应的培养箱，达到科研和临床检测的目的。,再见,