病毒抗原与抗体检测技术课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,病毒抗原与抗体检测技术,二、影响反应的因素,电解质,pH,7,时,适当电解质使其结合可见凝集团或沉淀,温度,37,温度升高,反应加快,56,酸碱度,pH68,接近等电点时易出现假阳性,第一节 免疫荧光技术,Immunofluorescence assay IFA,能解决:是什么 在哪里 有多少,荧光,激发光谱,发射光谱,荧光效率,荧光寿命,荧光猝灭,荧光偏振,第一节 免疫荧光技术,荧光物质,荧光物质,最大吸收光谱,最大发射光谱,应用,异硫氰酸荧光素,(FITC),490,495nm,520,530nm,(黄绿色),FAT,、荧光偏振免疫测定,四乙基罗丹明,(RB200),570,575nm,595,600nm,(橙红色),FITC,的衬比染色或双标记,FAT,四甲基异硫氰酸罗丹明,(TRITC),550nm,620nm,(橙红色),FITC,的衬比染色或双标记,FAT,藻红蛋白(,PE,),490-560nm,595nm,(红色),双标记,FAT,、流式细胞术,7-,氨基,-4-,甲基香豆素,354nm,430nm,(蓝色),双标记或多标记,FAT,Eu,3+,螯合物,340nm,613nm,时间分辨荧光免疫测定,二、免疫荧光试验,(一)原理,用荧光标记物标记病毒抗原或抗体,作为分子探针,检查细胞或组织内相应的病毒抗体或抗原。荧光标记物受激发光照射后发光,用荧光显微镜观察,可确定病毒种类、定位、定量。,二、免疫荧光试验,(二)类型,荧光抗体法,荧光抗原法,免疫细胞(组织)化学技术,二、免疫荧光试验,(三)方法,制备标本,制备荧光抗体,荧光抗体染色,荧光显微镜检查,二、免疫荧光试验,1、,制作病毒染色标本,培养敏感细胞(细胞爬片),种毒,固定、干燥,丙酮,二、免疫荧光试验,1、,制作病毒染色标本,临床样本(非固型组织),涂片,固定、干燥,二、免疫荧光试验,1、,制作病毒染色标本,尸检样品(,35mm,), ,脱水脱色 冰冻切片 印片, ,石蜡固定、脱蜡 丙酮固定、干燥,二、免疫荧光试验,2、,荧光抗体制备,制备抗体,用高纯度病毒免疫,动物,获取血清,分离,IgG,提纯,家兔、绵羊、山羊,高特异性 高亲与力,二、免疫荧光试验,2、,荧光抗体制备,标记荧光素 共价键结合,抗体,+,荧光素,4,持续搅拌数小时,纯化(离心、透析、过滤),二、免疫荧光试验,3、,鉴定制成的荧光抗体 以,FITC,为例,荧光(,F,)蛋白(,P,)结合率,调整,制备液至,A,280mm,=1,2、87A,495mm,A,280mm,-0、35A,495mm,比值越大,抗体结合荧光素越多,F/P=,二、免疫荧光试验,3、,鉴定制成的荧光抗体,测定抗体效价:双向免疫扩散试验,抗体特异性:吸收试验、抑制试验,抗体特异性染色滴度:倍比稀释,二、免疫荧光试验,4、,荧光抗体染色,直截了当法,二、免疫荧光试验,4、,荧光抗体染色,间,接法,二、免疫荧光试验,4、,荧光抗体染色,补体,法,荧光标记抗补体抗体,双标记法,两种荧光素抗体检测两种抗原,二、免疫荧光试验,5、,设立对比 区分特异性与非特异性染色,标本自发荧光对比,荧光抗体对比,阳性抗原对比,阻断试验,三、免疫荧光显微镜技术,荧光显微镜,利用一定波长的激发光对样品进行激发,产生一定波长的荧光,对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。,三、免疫荧光显微镜技术,光源:高压汞灯、氙灯或卤素灯,滤光片:隔热、激发与吸收滤光片,光路:透射光、落射光,聚光器:明视野、暗视野与相差荧光聚光器,镜头:消色差镜头,三、免疫荧光显微镜技术,透射光:照明光线从标本下经聚光器透过标本进入物镜。,落射光:照明光线从标本上经垂直照明器落射到标本,经标本反射进入物镜。,四、时间分辩免疫荧光技术,Time-resolved fluoroimmunoassay TR-FIA,(一)原理,自发荧光寿命短,:1ns,10ns,镧系元素寿命长,:10s,1000s,短寿命荧光完全衰变后再测定镧系元素特异荧光,铕,Ed,3+,锝,Tb,3+,钐,Sm,3+,镝,Dy,3+,四、时间分辩免疫荧光技术,(二)方法类型,双抗体夹心法,固相抗体与,Eu,3+,标记抗体与待检抗原结合,形成固相抗体,-,待检抗原,-Eu,3+,标记抗体复合物,酸性增强液下,Eu,3+,解离,340nm,激发光下发射,613nm,荧光。,四、时间分辩免疫荧光技术,(二)方法类型,固相抗体竞争法,待检抗原与,Eu,3+,标记抗原与固相抗体竞争结合,温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强度,荧光强度与待检抗原含量成反比。,固相抗原竞争法,待检抗原与固相抗原竞争结合定量的,Eu,3+,标记抗体,温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强度,荧光强度与待检抗原含量成反比。,第二节 酶免疫技术,Enzyme immunoassay,抗原抗体反应特异性,酶高效催化反应专一性,第二节 酶免疫技术,酶,底 物,显色反应,测定波长,辣根过氧化物酶,HRP,邻苯二胺,OPD,四甲替联苯胺,TMB,氨基水杨酸邻联苯甲胺,2,2,-,连胺基,-2(3-,乙基,-,并噻唑啉磺酸,-6),铵盐,橘红色黄色棕色兰色,蓝绿色,492,460,449425642,碱性磷酸酯酶,AP,4-,硝基酚磷酸盐,(PNP),萘酚,-AS-Mx,磷酸盐,+,重氮盐,黄色红色,400500,葡萄糖氧化酶,ABTS+HRP+,葡萄糖葡萄糖,+,甲硫酚嗪,+,噻唑兰,黄色深蓝色,405,420,-,半乳糖苷酶,甲基伞酮基半乳糖苷,(4MuG),硝基酚半乳糖苷,(ONPG),荧光黄色,360,450420,第二节 酶免疫技术,酶标记,戊二,醛交联法,过碘酸氧化法,醛基,酶,蛋白质,HRP,过碘酸盐,HRP,醛基,第二节 酶免疫技术,固相载体,塑料制品,微粒,膜,载体,NC,膜、尼龙膜,第二节 酶免疫技术,包被与封闭,包被,适宜浓度蛋白质,封闭,二,次包被填补空隙 小牛血清,二、酶联免疫吸附试验,Enzyme-linked immunosorbent assay ELISA,酶标记抗体(抗原)与待测抗原(抗体)发生特异性反应,加入酶底物,通过酶对底物的显色反应,对待测抗原(抗体)进行定位、定性或定量分析。,间接法,检测抗体,+,+,+,固相抗原 标本 酶标抗体 底物 显色,双抗体夹心法,检测抗原,+,+,+,固相抗体 标本 酶标抗体 底物 显色,竞争法,可检测抗原、抗体,YYY,+,YYY,+,YYY,参考管,酶标抗原,YYY,+,YYY,+,YYY,待测管,酶标抗原,抗原,捕获法,检测,IgM,抗体,+,+,+,抗,IgM,标本 抗原 酶标抗体 显色,（含,IgM,）,+,三、免疫酶染色试验,Immunoenzymatic staining test IEST,酶标抗体(抗原),抗原(抗体)复合物,底物,有色底物,三、免疫酶染色试验,细胞免疫酶染色,均,相酶免疫测定,无需分离游离与结合的酶标记物,酶标记物结合后改变酶活性,非均相酶免疫测定,需分离游离与结合的酶标记物,液,相:用二抗或沉淀去除游离酶标记物,固相:,ELISA,第三节 放射免疫技术,Radioimmunoassay RIA,利用放射性核素灵敏精确性与抗原抗体反应特异性相结合进行定量分析,放射免疫,核素标记抗原与未标记抗原竞争性结合特异性抗体,免疫放射,核素标记抗体结合待测抗原,R、S、 Yalow,第三节 放射免疫技术,125,I,、,131,I,、,3,H,、,14,C,标记,纯化,鉴定,放射性,免疫活性,第三节 放射免疫技术,第三节 放射免疫技术,放射免疫,竞争法,+,+,+,+,+,+,+,+,Bound,Free,Ag,Ab,6/8=0、75,4/8=0、5,2/8=0、25,1/8=0、125,B/B+F,第三节 放射免疫技术,放射免疫,以未结合的,Ag*,为,F,Ag*Ab,复合物为,B,则,B/F,或,B/(B,F),与,Ag,的量变存在着函数关系剂量反应,曲线,第四节 血清学试验,中与试验,血凝,/,血凝抑制试验,补体结合试验,一、中与试验,neutralization test,体外将病毒与特异性抗体混合并发生反应,再将混合物接种至敏感的宿主体内,然后测定残存病毒感染力的方法。,中与抗体,一、中与试验,(一)原理,中与抗体存在使病毒不能吸附与穿入宿主细胞,使病毒失去感染力。,当病毒与抗体混合后,接种敏感宿主细胞再观察敏感宿主的情况,即观察残存的病毒对宿主的感染力。,一、中与试验,(二)方法步骤,病毒,-,已知滴度,并有感染力,测滴度:细胞培养,将病毒,10,倍稀释,接种敏感细胞或动物,观察,CPE,或动物感染情况,确定滴定终点以,CCID,50,或,LD,50,表示,标准病毒试验浓度:,100 CCID,50,/,单位体积或,100 LD,50,/,单位体积,一、中与试验,抗体,用细胞培养法测病毒抗体的滴度:将,倍比稀释,的病毒抗血清液与等量的标准病毒液混合,接种敏感细胞,观察,CPE,。,病毒抗体滴度的确定:抗血清保护细胞免受病毒感染的最高稀释倍数的倒数。,抗体滴度的含义:抑制,CPE,的最高稀释倍数的抗血清中,每单位体积含一个抗体单位。,一、中与试验,举例,如观察结果是,1,:,10,至,1,:,320,抗血清均能抑制病毒的,CPE,也就是当抗血清稀释到,320,倍时,0、1ml,抗血清含有,1,个抗体单位。,请问:,1,:,160,及,1,:,40,含有几个抗体单位？,标准抗体浓度为,20,个抗体单位,/0、1ml,一、中与试验,宿主,细胞培养,:,观察,CPE,与空斑(最理想与常用),鸡胚:观察鸡胚的死亡(流感)、绒毛尿囊腔上痘疮及血凝现象(天花、牛痘、,HSV,),动物(小白鼠),:,成年与幼鼠易感,如乙脑病毒、森林脑炎病毒,一、中与试验,(二)方法步骤,固定血清,稀释抗病毒法,检测病毒及其滴度,固定,病毒,稀释抗血清法,检测血清效价,一、中与试验,(二)方法步骤,固定血清,稀释病毒法,用中与试验方法鉴定病毒时,将不同稀释倍数的病毒与标准的抗血清,(20,个抗体单位,/,单位体积,),混合、孵育,使二者充分反应,然后将混合液接种到敏感宿主体内,观察试验结果。,固定血清稀释病毒法,试验材料,宿主,:,敏感细胞与动物、鸡胚,标准抗病毒血清,(20,个抗体单位,/0、1ml),病毒分离物,试验步骤,不同浓度病毒液与等量的抗病毒血清混合细胞培养液倍比稀释病毒,不同浓度病毒液与等量阴性血清混合,接种细胞,设正常细胞对比,CO,2,孵箱观察,CPE,中与试验病毒,CCID,50,:,当抗血清组的,CCID,50,与阴性组之差的对数大于,2,才说明中与试验阳性。,固定血清稀释病毒法,阴性血清病毒,CCID50,的计算,病毒,稀释度,CPE,孔数,/,接种孔数,累计数,CPE,数 存活数,CPE,阳性比例,CPE,阳性率(),10,-4,5/5,10 0,10/10,100、0,10,-5,4/5,5 1,5/6,83、0,10,-6,1/5,1 5,1/6,17、0,10,-7,0/5,0 10,0/10,0,固定血清稀释病毒法,距离比例(大于,50%,的,CPE,阳性率,50%,),/,(大于,50%,的,CPE,阳性率小于,50%,的,CPE,阳性率)(,83,50,),/,(,83,17,),0、5,lgCCID,50,=,大于,50%,的,CPE,阳性率血清稀释度的对数,+,距离比例,稀释系数的对数,=lg10,-5,+0、5 lg0、1=-5、5,其反对数是,10,-5、5,、,阴性血清组的病毒,CCID,50,为,10,-5、5,/0、1ml,。,固定血清稀释病毒法,阳性血清病毒,CCID50,的计算,病毒,稀释度,CPE,孔数,/,接种孔数,累计数,CPE,数 存活数,CPE,阳性比例,CPE,阳性率(),10,-2,5/5,10 0,10/10,100、0,10,-3,3/5,5 2,5/7,71、0,10,-4,2/5,2 5,2/7,29、0,10,-5,0/5,0 10,0/10,0,固定血清稀释病毒法,距离比例(大于,50%,的,CPE,阳性率,50%,),/,(大于,50%,的,CPE,阳性率小于,50%,的,CPE,阳性率),(,71,50,),/,(,71,29,),0、5,大于,50%,的,CPE,阳性率血清稀释度的对数,+,距离比例,稀释系数的对数,=lg10,-3,+0、5 lg0、1=-3、5,其反对数是,10,-3、5,。,阳性血清组的病毒,CCID,50,为,10,-3、5,/0、1ml,。,因抗血清组的,CCID,50,为,10,-3、5,阴性血清组的病毒,CCID,50,为,10,-5、5,因此,10,-3、5,-10,-5、5,=2,表明分离的病毒是与中与抗体相对应的病毒。,一、中与试验,(二)方法步骤,固定病毒,稀释血清法,用于血清抗体滴度的测量。用已知病毒检测位置抗体滴度。,100 CCID,50,/,单位体积的病毒,+,连续倍比稀释血清,孵育,1h,接种敏感宿主,观察不同稀释度的血清保护宿主感染病毒的情况,固定病毒稀释血清法,试验材料,:,敏感宿主,标准滴定的病毒,100CCID,50,/0、1ml,急性期或恢复期血清,试验步骤,细胞培养液倍比稀释急性或恢复期血清,取不同稀释浓度血清与标准病毒混合并,37,孵育,1h,取混合液,0、2ml,接种细胞,CO,2,孵箱观察,CPE,50,血清中与终点:,50%,细胞不产生细胞病变的血清稀释度,固定病毒稀释血清法,恢复期血清中与病毒的结果,血清,稀释度,CPE,孔数,/,接种孔数,累计数,CPE,数 无,CPE,数,CPE,阳性比例,CPE,阳性率(),1,:,16(10,-1、2,),0/4,0 8,0/8,0、0,1,:,32(10,-1、5,),1/4,1 4,1/5,20、0,1,:,64(10,-1、8,),3/4,4 1,4/5,80、0,1,:,128(10,-2、1,),4/4,8 0,8/8,100、0,固定病毒稀释血清法,距离比例(,50%,小于,50%,的,CPE,阳性率),/,(大于,50%,的,CPE,阳性率小于,50%,的,CPE,阳性率),(,50,20,),/,(,80,20,),0、5,50%,血清中与终点的范围,:1:32,与,1:64,之间。,中与终点浓度,=,小于,50%,的,CPE,阳性率血清稀释度的对数,+,距离比例,稀释系数的对数,=lg10,-1、5,+0、5 lg0、5=-1、65,其反对数是,1/45,即,50%,血清中与终点为,1:45,含义:,1:45,稀释度的恢复期血清可保护,50%,细胞不产生细胞病变效应。,二、血凝,/,血抑,血凝,HA,血凝抑制,HI,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12,血凝试验,HA,试验方法,选择,96,孔板(,V,型),病毒液倍比稀释,稀释好后加鸡红细胞,混匀后,20,室温静置,30min,+50l PBS,吸出一半,1:2,1:2,2,1:2,3,1:2,4,+100l,病毒液,+50l,鸡红细胞,吸弃一半,血凝试验,HA,血凝滴度:,以出现,+,的稀释度的倒数为判定终点,为,1,个血凝单位。,凝集,效价:,能使血球产生,+,凝集的病毒最高稀释度为病毒的凝集效价,即,0、5ml,病毒液含,1,个血凝单位。,三、补体结合试验,补体:正常人与动物血清与组织液中的一组经活化后具有酶活性的蛋白质,辅助抗体介导免疫溶菌与溶血作用。对热不稳定。,绵羊红细胞与抗绵羊红细胞抗体(溶血素)作用形成溶血素致敏的绵羊红细胞。补体可使这种致敏红细胞溶解。,补体可结合任何病毒抗原抗体复合物,三、补体结合试验,假如反应系统中存在待测的抗体(或抗原),则抗原抗体发生反应后可结合补体;再加入指示系统时,而不出现溶血,是为补体结合试验阳性。,假如反应系统中不存在的待检的抗体(或抗原),则在液体中仍有游离的补体存在,当加入指示系统时会出现溶血,是为补体结合试验阴性。,三、补体结合试验,有,3,个系统:,反应系统,即已知的抗原(或抗体)与待测的抗体(或抗原);,补体系统;,指示系统,即,SRBC,与相应溶血素,形成致敏红细胞。,三、补体结合试验,病毒抗原,从组织培养、鸡胚与动物试验中获得病毒抗原,应适当提纯,纯度愈高,特异性愈强,如使用粗制抗原时,须经同样处理的正常组织作抗原对比,以识别待检血清中估计存在的、对正常组织成分的非特异性反应,三、补体结合试验,抗体,免疫用的病毒抗原最好不是同一细胞或动物,以免发生交叉反应,血清样品应加热灭活处理,消除补体活性与非特异性抗补体活性,人与豚鼠灭活温度为,56,;家兔与马灭活温度为,65,三、补体结合试验,补体,检测人与哺乳动物血清应用豚鼠新鲜血清补体,临用前使用,1,SRBC,制备,绵羊颈静脉采血,生理盐水洗涤,溶血素,用绵羊红细胞免疫家兔获得,效价达到,1:4000,可获得,56,30,分钟灭活,加甘油后长期保存,稀释液,含钙镁离子的生理盐水,可维持补体的稳定,三、补体结合试验,溶血素的滴定,先将溶血素稀释成,1:1001:1000,再依次加入溶血素,0、1ml,钙镁盐水,0、2ml,1:60,补体,0、2ml,、,1,绵羊红细胞,0、1ml,混匀后再水浴,结果判定:完全溶血的试管液体红色透明,离心后见少许细胞,;,不溶血的试管液体混浊,放置后见红细胞沉淀,上清无色透明,溶血素效价的测定,;,以完全溶血的最高稀释倍数确定为,1,个单位,本例,1,个单位的溶血素的效价为,1,:,4000,;正式使用,2,个单位,三、补体结合试验,补体的滴定,补体不稳定,每次试验前需滴定,管号,1,:,60,补体,钙镁盐水(,ml),2U,抗原,(ml),1,致敏,SRBC(ml),结果,1,0、04,0、26,0、1,0、2,不溶,2,0、06,0、24,0、1,0、2,不溶,3,0、08,0、22,0、1,0、2,微溶,4,0、10,0、20,0、1,0、2,微溶,5,0、12,0、18,0、1,0、2,全溶,6,0、14,0、16,0、1,0、2,全溶,7,0、14,0、14,0、1,0、2,全溶,感谢您的聆听！,