蛋白质的表达纯化

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验八 蛋白质的表达、分离、纯化和鉴定,(1),了解重组蛋白表达的方法和意义。,(2),了解亲和层析分离纯化的方法。,实验原理,克隆基因在细胞中表达对理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，同时克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统，其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的,80%,。,本实验中，携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌,BL21,中，在,37,，,IPTG,诱导下，超量表达携带有,6,个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（,NTA,）使镍离子（,Ni2+,）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（,MCAC,）。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。,材料与试剂,试剂,1 LB,液体培养基：,Trytone 10g,yeast extract 5g,NaCl 10g,用蒸馏水配至,1000mL.,2,氨苄青霉素：,100mg/mL,3,上样缓冲液,(GLB),：,100 mM NaH2PO4,10 mM Tris,8M Urea,10 mM 2-ME,pH8.0,4 Washing Buffer,（,UWB,）：,100 mM NaH2PO4,10 mM Tris,8 M Urea,pH6.3,5 Elution Buffer(,洗脱,):100 mM NaH2PO4,10 mMTris,8M Urea,500 mM Imidazole,pH8.0,6 IPTG,实验步骤,一、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导,1.,接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌,BL21,菌株于,5mL LB,液体培养基中（含,100ug/mL,氨苄青霉素），,37,震荡培养过夜。,2.,转接,1mL,过夜培养物于,100mL,（含,100ug/mL,氨苄青霉素）,LB,液体培养基中，,37,震荡培养至,OD600=0.6-0.8,。取,10ul,样品用于,SDS-PAGE,分析。,3.,加入,IPTG,至终浓度,0.5 mmol/l,37,继续培养,1-3h.,4.12,，,000rpm,离心,10 min,弃上清，菌体沉淀保存于,-20,或,-70,冰箱中。,二、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的分离，纯化,1.,重组蛋白的变性裂解：在冰浴中冻融50,ml,菌体沉淀，加入,5mL,上样缓冲液,GLB,用吸管抽吸重悬,4 12000rpm,离心,30 min,将上清（总蛋白细胞裂解液）吸至一个干净的容器中，并弃沉淀。,2.NTA,层析柱的准备：在层析柱中加入,1mL NTA,介质，并分别用,8mL,去离子水，,8mL,上样缓冲液,GLB,洗涤。,(调速0.5,ml/3,分钟)。,3.,细胞裂解液3,mL,以,10-15mL/h,流速上,Ni2+-NTA,柱，收集流出液。,4.洗脱杂蛋白：用,50mL,洗涤缓冲液,UWB,以,10-15mL/h,流速洗柱，分别取,10ul,洗涤开始与结束时的样品用于,SDS-PAGE,分析。,5.,洗脱目标蛋白：用,10mL,洗脱缓冲液洗柱，每管,0.51 mL，,共收集610管，分别取,10ul,样品用于,SDS-PAGE,分析。,1,装配制胶用的玻璃板（由助教演示）。,2,制分离胶：按所需的浓度配制,12.5,分离胶,。,30%Acr-Bis,Tris-HCl pH 8.8,H,2,O,10%AP,TEMED,5ml,3ml,4ml,120ul,20ul,灌完分离胶后在胶面上小心加水封（注意不要冲坏胶面），等胶自然凝聚后（这时候在胶面与水封之间可以看见清晰的界限）,3,制浓缩胶：按所需的浓度配制,4%,的,浓缩胶,，配方如下：,30%Arc-Bis,Tris-HCl pH 6.7,H,2,O,10%AP,TEMED,400ul,750ul,1800ul,50ul,10ul,4.,灌完浓缩胶，插入梳子。等到浓缩胶自然凝聚后，将装置放入电泳槽内,加入电泳缓冲液,小心地拔出梳子，如果拔出梳子后加样孔之间的间隔发生扭曲，可以用注射器针头小心地加以整理。,5,加样：取大肠杆菌和,BSA,蛋白样品加样，每个加样孔加样不宜过多，一般每孔加样,10,L,。,6,电泳：先恒压,80V,，待样品进入分离胶后，调电压为,120V,（恒压）。当溴酚蓝移动到离底部约,0.5cm,时，停止电泳。,7,翘开玻璃板，将浓缩胶切掉,剥下凝胶，准备染色。,8,凝胶染色：使用考马斯亮蓝,R250,染色。两块胶（小盒子）或四块胶（大盒子）同步染色脱色。盖上盖子用微波炉加热约,15-20,秒，摇床振荡,15,分钟，,回收染液至指定容器,。清水漂洗后加入脱色液（,25%,乙醇，,75%,乙酸）脱色，用量和步骤与染色相同，脱色两次，每次,10,分钟。,注意事项,(1)Acr,和,Bis,均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，操作时应戴手套和口罩。,(2),玻璃板表面应光滑洁净，否则在电泳时会造成凝胶板与玻璃板之间产生气泡。,(3),样品槽模板梳齿应平整光滑。,(4),灌凝胶时不能有气泡，以免影响电泳时电流的通过。,(5),切勿破坏加样凹槽底部的平整，以免电泳后区带扭曲。,（,6,）电泳时应选用合适的电流、电压，过高或者过低都会影响电泳效果。,(7),稀释,5SDS/,电泳缓冲液至,1,浓度灌入电泳槽，需,800,毫升。,1.,将红色玻璃夹子底座朝下、卡口打开呈直角状，放入厚薄两片玻璃，薄玻璃朝向自己。注意厚玻璃箭头向上，旁边两条小玻璃条与薄玻璃接触，使之形成一个间隙。,2.,在平整的桌面上放下玻璃与夹子，使玻璃和夹子的底面完全对齐，向外扳动塑料卡口，关紧夹子。,3.,将做好的玻璃夹放在制胶架上，注意薄玻璃朝向自己，厚玻璃上的箭头向上。按弹簧夹，将玻璃夹卡入制胶架。在玻璃的间隙内灌胶，放上梳子，待胶凝固。,4.,取出制好的玻璃（连带胶），将玻璃放入电极架（卡在底面的卡口上），注意薄玻璃朝向电极架，厚玻璃的箭头朝上，玻璃与红色橡胶条必须完全紧贴。（需同时放置两块制好的胶，如只使用一块则另一面须用提供的塑料板代替，注意塑料板上的提示，必须使塑料板与橡胶条完全紧贴。）正常安装则会形成一个密闭的容器。,5.,将底座的开关打开，并向外拨动透明的架子，使中间空隙增大，放入电极架。,6.,如图所示将电极架往下压（约,12mm,），使底面完全接触。,7.,关上底座开关。,8.,放入电泳槽内，加上加样架加样。注意加样架与刚才制胶所用的梳子齿数必须一致。,