芽孢型乳酸杆菌

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,芽孢型乳酸杆菌的筛选与分离,小组成员 刘晓 童微,肖宇丹 尤瑶,目录,1,前言,1.1,益生菌,-1,1.2,芽孢杆菌,-3,1.3,研究意义,-6,2,实验,2.1,实验材料,-6,2.2,试验方案,-7,2.3,实验人员的分工,-7,3,预期进度及经费,-8,4,可能存在问题,8,5,参考文献,-8,前言,1.1,益生菌,1.1.1,益生菌的定义,“益生素,(,probioties,)”,一词最早由,Lilley,和,Stillweu,在,1965,年使用，被定义为“由一种微生物分泌刺激另一种微生物生长的物质”,(,姜文侠等，,2000),。,1974,年，,Parke:,定义益生素为“维持肠道内微生态平衡的活的或死的微生物及其代谢产物”,(Parker,，,1974),。,1989,年，,Fulle,:,定义益生素为“一种可通过改善肠道菌群平衡，对动物施加有利影响的活微生物饲料添加剂”,(Fuller,，,1989),。关于益生菌的精确定义，虽然众说纷纭，但都包含了以下两个基本性质,:,一是益生菌是活的微生物,;,二是通过摄入充足的数量，对宿主产生功能性健康益处,(,Fulleretal,，,1997),。益生菌种类繁多，目前应用比较广泛的有乳酸杆菌、粪链球菌、屎链球菌、枯草芽抱杆菌、双歧杆菌、酵母菌、腊样芽饱杆菌、凝结芽抱杆菌等。,1.1.2,益生菌的作用机理,益生菌主要通过以下途径在体内发挥其作用：（,1,）补充有益菌群，维持消化道菌群平衡，预防和治疗菌群失调症。通过有益菌群对致病菌的生物拮抗作用,(,如产生乳酸、乙酸等有机酸类的抑菌物质，分泌小分子的抗菌肽，竞争性的与肠粘膜上皮细胞受体位点结合,),，降低肠道和粪便中的致病菌如葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌等的含量（,2,）刺激机体免疫系统，提高机体体液免疫和细胞免疫水平从而抵抗某些病原体的感染，增强抗病能力；（,3,）参与菌群生存竞争，协助机体消除毒素和有害代谢产物（,4,）通过产生多种消化酶，改善机体代谢，直接产生氨基酸、,维生素等营养物质，补充机体营养成分，促进机体生长,1.1.3,益生菌的种类,由于益生菌具有多种生理功能而本身无毒、无残留、无耐药性等优点，故越来越广泛地引起人们的关注，并具有很大的市场潜力。根据美国药品与食品管理委员会公布的统计结果，目前可被安全使用的有益微生物有,43,种，包括乳酸菌、链球菌、肠球菌、酵母菌、芽孢杆菌、真菌等。其中以乳酸菌中的能够在胃肠道中存活的双歧杆菌和乳酸杆菌研究最多，应用也最广泛。目前，活跃于市场的部分益生菌菌株有：芬兰,Valio,公司的鼠李糖乳杆菌,LGG,，美国,BioGaia,公司的露特乳杆菌,1063,，日本,Yakult,公司的干酪乳杆菌,Shirota,，瑞士雀巢公司的嗜酸乳杆菌,LA1,，丹麦科汉森公司的双歧杆菌,BB12,等,1.1.4,益生菌的特性,益生菌发挥益生功能有两个前提条件：耐酸耐胆盐和吸附定值。益生菌通常由食物携带或以制剂形式口服，进入人体后，菌体首先通过环境恶劣的胃液，同时要抵抗来自胰腺的胆汁盐，最后到达大肠，定植后发挥其生理功效胃酸和胆汁盐具有抗菌性，益生菌能否抵抗这二者的破坏，是其在肠道中存活、生长和发挥作用的先决条件，而且其在人体肠道内存活能力高低直接关系到该菌体能否发挥健康促进作用，据报道，只有摄入含有,106,108cfu/mL,以上的益生菌才能充分发挥其健康促进的特性。吸附是细菌定植细胞的前提，益生菌一般不能在宿主体内永久性的定植,(,寄生宿主除外,),，这是因为每个个体都有自身独特的微生物菌群，任何外源细菌都很难在其中定植下来。摄入的益生菌毕竟不同于肠道中天然菌群中的细菌，因此大多数情况下都不能永久性定植。但是益生菌可以在肠道中生存一段时间，为有益菌的生长创造良好的环境。另外，作为益生菌还必须要有一个重要的性质，就是对宿主的安全性。用于研究的菌株主要集中于拥有较长安全使用历史的菌株，它们或来源于传统的、被证明有健康疗效的食品，或来源于健康个体的胃肠道系统。益生菌的安全性主要包括以下几个方面（,1,）应用于人类的益生菌最好来自人体；（,2,）益生菌必须经过一定时间证明其无致病性；（,3,）益生菌不能有与一些疾病,(,如心内膜炎、肠道不适症,),相联系的历史；（,4,）益生菌不能使胆盐早期解离；（,5,）益生菌不能携带可以转移的抗抗生素基因。,1.2,芽孢杆菌,1.2.1,芽孢杆菌的定义和一般特征,芽孢杆菌（,Bacillus,），杆菌科的一属细菌，大多为好氧或兼性厌氧，革兰氏染色阳性，是一类能够在逆境下形成休眠体芽孢以抵抗不良环境的杆状腐生细菌。它在自然界中广泛存在，其特点是耐酸、耐盐、耐高温、耐挤压，并可以代谢产生蛋白酶、淀粉酶、脂酶等多种酶类以及杆菌肽、大环脂、环脂、类噬菌体颗粒等十几种抗菌物质。芽孢杆菌的特征主要有如下几个方面：（,1,）芽孢的形成并非细菌“生活史”中的一个不可缺少的过程，它的形成受环境因素的影响，不同的菌种形成芽孢的条件不同。当芽孢杆菌生长到一定阶段时，由于环境苛刻或营养供给不足，这时在细胞内形成一个近似圆形的内生孢子，称为芽孢。芽孢位于菌体中央，但不大于菌体宽度，专性需氧，结构复杂，新陈代谢几乎停止，处于休眠状态，对热、干燥、辐射、酸、碱和有机溶剂等杀菌因子具有极强的抵抗力，在不利条件下，可保持生命数十年。（,2,）芽孢的结构：未染色的细菌芽孢，在光学显微镜下，折光性强，呈透明的气泡状。芽孢的详细结构可用电子显微镜观察。一般来说，成熟的芽孢，中央为髓质，往外依次为内膜、初生芽孢壁、皮质、外膜、芽孢鞘和芽孢外衣。,2,，,6-,吡啶二羧酸被认为是形成芽孢抗热性的重要因素，但有研究者发现在,2,，,6-,吡啶二羧酸缺陷的菌株中也形成了抗热芽孢，因而对其是形成芽孢抗热性的决定因素有了争议。在芽孢杆菌属中，对种的划分是以菌体的大小、孢子的形状及其在菌体内的位置、糖的利用及其产物能否还原硝酸，以及在高浓度的食盐条件下能否生长等为依据。,3,）应用特性：当芽孢杆菌制剂进入动物体肠道后，芽孢迅速发育转化为具有新陈代谢作用的营养型细胞，并消耗大量的氧气，使局部的氧分子浓度降低，抑制肠道内有害菌的生长，从而调节肠道内微生物菌群的平衡。,1.2.3,芽孢杆菌作为益生菌的作用机理,（,1,）,生物夺氧，抑制有害菌,肠道原籍菌群,(Autochthonous flora),或称常驻菌,(Resident flora),是肠道的优势菌，多是厌氧菌,(Anaerobe),，而外籍菌群,(,Allochthonous,flora),或称过路菌,(Transient flora),多为需氧菌,(Aerobe),。芽孢杆菌制剂进入动物肠道内后，芽孢迅速发育转变为具有新陈代谢作用的营养型细胞，并消耗大量的氧气，使局部的氧分子浓度下降，保持肠道内的厌氧环境，降低氧化还原电势，增强肠道对需氧菌的定植抗力,(,Colonizationresistence,),。定植抗力指宿主对致病菌与潜在致病菌在正常微生物群中定植和繁殖的阻抗力或抵抗力，其受宿主因素和正常微生物群的双重影响。宿主因素主要有机械清除,(,如肠蠕动、纤毛运动等,),、黏液分泌、上皮细胞脱落和分泌免疫球蛋白抗体,(,IgA,),，而正常微生物群主要来自其他厌氧菌的成员。定植抗力的增加以肠道部分最为明显。例如，在应用活菌制剂整肠生时，由于地衣芽孢杆菌这一争夺氧气菌种在肠道内的定植，会持续地对内环境产生生物效应，限制需氧性病原菌的繁殖而支持肠道内的生理厌氧菌的繁殖，有利于肠道正常菌群的生长，维持原有的微生态平衡，起到防病促生长的作用。陈惠等给生长育肥猪饲喂芽孢杆菌后，发现肠道菌群中厌氧菌增多，而需氧菌及兼性厌氧菌特别是大肠杆菌显著减少。,（,2,）,拮抗病原微生物，维持和调整肠道微生态平衡,动物肠道正常微生物群的种类及其数量处于一个动态的平衡之中，这种平衡虽然相当稳定，但仍受到食物或环境因素的影响，如抗生素治疗或应激。这种平衡在未建立起或一旦被打破时，一些次要微生物如大肠杆菌大量增殖，比例增加，导致机体出现危急状态。微生态制剂中的有益菌对病原菌有拮抗作用，这些有益菌定植在肠粘膜上皮的靶细胞上，同病原菌争夺有限的营养物质和生态位，竞争性抑制病原菌的吸附和定植，使病原菌不能生长繁殖，从而阻止其侵害。程安春等,(1994),和淳泽等,(1994),用体外生物拮抗研究表明，芽孢杆菌对猪致病菌大肠杆菌、猪霍乱沙门氏菌、鸡大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌有拮抗作用。（,3,）产生有益代谢产物,Sogaard(1990),研究表明枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌具有较强的产蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性，同时还能降解如木聚糖、地衣聚糖、果胶、梭甲基纤维素、多聚半乳糖醛酸以及其他一些复杂的植物性碳水化合物。并且芽孢杆菌在胃和肠道上部可产生乳酸、丙酸、乙酸等物质使肠道内的,pH,降低，在肠道下部产生挥发性脂肪酸等有益代谢产物，抑制有害微生物的生长，并有助于动物特别是幼小动物营养物质的消化，尤其是蛋白质的消化吸收。,Savage(1977),估计在动物盲肠中的微生物可以为动物提供维生素需要量的,25%,30%,。,（,4,）增强免疫机能，提高抗病能力,作为非特异性的免疫调节因子，芽孢杆菌可以增强动物机体的免疫能力，从而,提高动物对疾病的抵抗能力。对于免疫系统不健全的幼龄动物的作用尤为明显。潘康成等,(1997),研究认为，地衣芽孢杆菌的免疫促进作用是机体经口服芽孢杆菌后，在肠道淋巴组织集合的抗原结合位点上直接作为免疫佐剂，或者通过调整宿主体内的微生物群，尤其是双歧杆菌菌群起主导，间接地发挥免疫佐剂的作用，从而提高机体局部或全身防御功能。,Himanen,(1993),研究表明枯草芽孢杆菌的脂磷壁酸和肽聚糖一磷壁酸复合物的生物活性具有免疫佐剂的功能。（,5,）净化环境 食物中未消化的蛋白质、脱落的粘膜细胞以及分泌性含氮物质在肠腔中被大肠杆菌和其他细菌脱梭后生成腐胺、吲哚、酚类等有害代谢产物，机体不能利用，并具有潜在的毒性。芽孢杆菌属细菌可产生氨基氧化酶、,SOD,酶、分解硫化氢的酶以及其他抗菌物质如过氧化氢，起到杀菌作用，减少肠道内有害物质的产生，降低肠上皮细胞的更新率，降低动物的维持需要,1.2.4,重要芽孢杆菌的应用,芽孢杆菌由于产生内生孢子，具有较强的抵抗外界不良环境的能力，能够抵抗所生存的环境中由于干燥、热和紫外线辐射所造成的伤害，维持自身能力不受影响，这个生物学特征使芽孢杆菌具有非常良好的应用前景，特别是在使用活菌制剂的生物制品中表现出强大的生命力。芽孢杆菌种类繁多，数量大，能够产生多种多样的生理活性物质，具有广泛的应用前景。,1.2.5,益生芽孢杆菌的作用优势,随着微生态技术的不断发展，芽孢杆菌的益生作用受到人们越来越多的关注，其应用领域也得到纵深扩展，被广泛地应用于医药、工农业和饲料添加剂中。与传统的益生菌（双歧杆菌和乳酸杆菌）相比，芽孢杆菌制剂的活性成份是休眠体芽孢，具有耐高温、耐干燥、耐酸碱和外力破坏等抗逆特点，在储藏过程中，芽孢又不消耗介质的营养成分，不影响其的品质，并且一般芽孢杆菌对营养物质的要求不高，生产工艺易于掌握，便于产品的加工、保存和运输。当芽孢进入动物体肠道后，在肠道上部迅速复活，活化为营养体，对动物机体产生益生作用,1.2.6,益生芽孢杆菌的应用现状及研究动态,目前，随着对芽孢杆菌研究水平的不断深入，国内外对于益生芽孢杆菌的作用优势有了广泛的认可，但是目前适宜作为益生菌的芽孢杆菌菌株并不多，而且已有产品中的活菌稳定性差，产品在贮存过程中活菌数降低快，产品的保质期短等，诸多因素限制了这类制剂在生产生活中的应用。针对上述芽孢杆菌的使用难点，国内外许多研究者对其益生作用的优化做了广泛的研究，认为：,（,1,）优良菌株的筛选是提高益生菌使用效果的最重要的途径，优秀的益生菌必须具备对肠道内不利于细菌生长的众多因素,(,如对低,pH,值、胆汁盐及消化