酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用-课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第四节 酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用,其应用主要包括以下几个方面：,药物含量（活性）测定,宿主蛋白残留检测,抗生素残留检测,杂质检测,污染物检测,药物原材料检测,药物掺假检测,第四节 酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用其应用主要包括以,一、,GLP-1,活性检测,Cyclic Adenosine Monophosphate(cAMP)ELISA Kit,一、GLP-1活性检测Cyclic Adenosine Mo,GLP-1,GLP-1是已发现的促胰岛素分泌作用最强的肠肽类激素，它通过与GLP-1受体(GLP-1R)结合发挥作用,1,）GLP-1可通过刺激胰岛素分泌、抑制胰高血糖素分泌及胃排空来降低血糖,2,）GLP-1还有减缓细胞凋亡，促进其再生的独特作用,3,）GLP-1还能减慢胃排空速度，通过作用下丘脑，抑制食欲。,GLP-1 GLP-1是已发现的促胰岛素分,GLP-1结合GLP-1R后，激活细胞膜内环腺苷酸(cAMP)和丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)通路,胰岛成熟细胞的GLP-1受体偶联Gs，活化腺苷酰环化酶，产生cAMP，后者与葡萄糖协同刺激胰岛素合成和分泌，刺激胰岛素基因转录和胰岛素原生物合成，可降低胰高血糖素浓度并抑制胰高血糖素分泌，增强细胞对胰岛素的敏感性，刺激胰岛素依赖性糖原合成，降低餐后血糖浓度。,GLP-1结合GLP-1R后，激活细胞膜内环腺苷酸(cAMP,3,5,3,5,Ligand,Ligand,s,AC,s,GTP,ATP,cAMP,PKA,Ca,2+,NFAT-,P,NFAT,Calcineurin,CREB-,P,NFAT-RE,CRE,F-Luciferse,R-Luciferse,GLP-1 Receptor,3,5,3,5,报告基因检测原理,3535LigandLigandsACsATPcAM,试验原理,采用直接竞争,ELISA,方法，在酶标板微孔条上预包被,cAMP,特异性抗体，样品中,cAMP,将和标准,HRP-cAMP,竞争结合微孔条上,cAMP,特异性抗体，用,TMB,底物显色，吸光值与样品中,cAMP,的含量成负相关。,以吸光值为纵坐标，样品浓度为横坐标，按四参数法回归拟合对照品和供试品的量效曲线,，,得出半效量浓度，求得供试品相对生物活性。,试验原理采用直接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被c,操作程序：,1、,取微孔板条，加入,cAMP,特异性抗体，,50ul/,孔，室温,1 h;,2、,洗涤后，向不同孔中分别,cAMP,、对照或细胞裂解上清品（样品），,100ul/,孔；,3、,向孔中加入,HRP-cAMP,，,50 ul/,孔，室温作用,2h；,4、,洗涤后，向孔中加入,TMB,溶液，,200 ul/,孔，室温作用,30min；,5、,向孔中加入终止液，,100 ul/,孔，测定,OD,450nm/570nm,操作程序：1、取微孔板条，加入cAMP特异性抗体，50ul/,数据与结果,1.,标准曲线的绘制：,（,1,）测定各浓度梯度下各孔对照品和供试品相应的吸光值，并分别计算平均值；,（,2,）以吸光值为纵坐标，样品浓度为横坐标，按四参数法回归拟合对照品和供试品的量效曲线，得出半效量浓度；,对照品,EC50,；测试样,EC50,2.,数据处理：,供试品相对生物活性（,%,）,=,对照品,EC50/,供试品,EC50,100%,其中：对照品和供试品的,EC50,分别表示对照品和测试样的半效量的浓度。四参数方程中的,C,值即相当于半效量的浓度,(EC50),。,数据与结果 1.标准曲线的绘制：,典型的测定结果及回归曲线,典型的测定结果及回归曲线,酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用-课件,二、宿主蛋白（,HCP,）残留检测,CygnusF550CHOHCPELISAKit,二、宿主蛋白（HCP）残留检测CygnusF550CH,宿主细胞蛋白污染物,CHO,宿主蛋白残留,E-coli,宿主蛋白残留,酵母菌宿主蛋白残留,HEK293,宿主蛋白残留,宿主细胞蛋白污染物 CHO宿主蛋白残留,2D分离CHO、酵母、大肠杆菌等细胞系的全蛋白谱,将2D Gel上的全蛋白转移至膜上，用多克隆抗体孵育后进行Western Blot化学发光检测，以确认多克隆抗体能够与哪些宿主细胞蛋白结合,通过Western Blot检测结果（多抗能检测到的HCP数量）与2D膜上检测结果（总HCP数量）的比较，得出用于评价检测的多克隆抗体特异性及适用性的Match Rate,评估HCP定量,用,多克隆抗体的特异性,2D分离CHO、酵母、大肠杆菌等细胞系的全蛋白谱评估HCP定,酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用-课件,试验原理,采用双位点酶联免疫检测法，在酶标板微孔条上预包被抗,CHO CHP,多抗，免疫反应构成为夹层式结构：固相抗体,-HCP-,酶标记抗体。反应结束后清洗酶标板去除未结合反应物，添加,TMB,底物显色，吸光值与样品中,CHO,宿主蛋白的含量成正相关。,试验原理采用双位点酶联免疫检测法，在酶标板微孔条上预包被抗C,检测步骤：,（1）于每个反应孔中，加入100 L抗CHO HCP多抗-,HRP,；,（2）从标准蛋白液、对照和样品中吸取50 L 上清加入到,已标记,好的反应孔中；180rpm下室温、振荡培养2h；,（,3,）弃去孔内溶液，每孔加350 L 洗涤液，重复洗涤4次；,（,4,）于每个反应孔中，加入100 L TMB底物溶液，于室温孵育30min；,（,5,）于每个反应孔中，加入100 L终止液；依序读取OD450/650 nm吸收值(空白对照孔调零)。,（,6,）数据处理：根据测定每孔标准液吸光值绘制四参数逻辑曲线，然后根据样品吸光值计算出样品中HCP浓度。,检测步骤：（1）于每个反应孔中，加入100 L抗CHO H,酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用-课件,酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用-课件,酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用-课件,酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用-课件,酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用-课件,ELISA,法研究药物作用靶点（,GPb/a,受体）,实验原理,根据,ELISA,实验原理，先在,96,孔板上包被纤维蛋白原，然后同时加入,GPIIb/IIIa,受体和待测样品，再加酶标抗体与,GPIIb/IIIa,受体结合，最后加入底物，酶作用于底物显色，在,405nm,测得,OD,值，,OD,值与,GPIIb/IIIa,受体量成正比。如果样品与,GPIIb/IIIa,受体结合，就会降低纤维蛋白原与受体的结合，导致所测的,OD,值降低。,ELISA法研究药物作用靶点（GPb/a受体）实验原理,实验步骤：,首先将纤维蛋白原（,10 g/ml,）用,buffer A,（,0.1 M Na,2,CO,3,PH 9.5,）包被于,96,孔板上（,100 l/well,）（空白对照,:,不包被纤维蛋白原），,4C,孵育过夜；,TACTS,（,0.02M Tris-HCl,PH 7.5,，,0.15M NaCl,，,1mM CaCl,2,0.02%NaN,3,0.05%Tween 20,）冲洗一次，每孔,200l,，,3min,；用含,1%BSA,的,TACTS,在,37C,封闭,1h,（,200 l/well,）,TACTS,洗三次；,整合素,IIb3,（,20 g/ml,、,50 L/well,）加一定浓度的待测样品,50 l,作为样品组；加孵育液做阴性对照组；,37C,下孵育,2h,；,TACTS,洗三次；加一抗（鼠抗人,CD61,抗体，含,0.5%BSA,TACTS,稀释，,1:2000(,体积比,),，,100L/,孔）,37C,下孵育,1h,；,实验步骤：,TACTS,洗三次；加二抗（碱性磷酸酶标记的山羊抗鼠,IgG,，含,0.5%BSA,TACTS,稀释，,1:1000,，,100L/,孔），,37C,下孵育,1h,；,TACTS,洗三次，加底物（对硝基苯磷酸二钠溶液,(PNPP)1mg/ml,，用,buffer B,溶解，,200L/well,），,37,下孵育,30min,；加入,50L 3M NaOH(,称,0.6g,加,5ml,蒸馏水,),终止反应；,5min,内,405nm,波长下检测吸光度。,TACTS 洗三次；加二抗（碱性磷酸酶标记的山羊抗鼠IgG，,数据处理,通过以下公式计算抑制率：,(XY)/(X-Z)100%,。,X,代表生理盐水组,OD,值；,Y,代表样品组,OD,值；,Z,代表空白对照组,OD,值。实验结果都用均数,标准差（,s,）表示，采用,t,检验进行单因素方差分析。,p1mg/ml,时较稳定。,7.buffer B（底物缓冲液）：定容100ml，PH,三、卡那霉素残留检测,卡那霉素检测试剂盒,三、卡那霉素残留检测卡那霉素检测试剂盒,2015年版药典凡例十六：（3）生产过程中，应尽可能避免使用抗生素，必须使用时，应选择安全性风险相对较低抗生素，使用抗生素种类不得超过1种，且产品后继工艺应保证可有效去除制品中抗生素，去除工艺应该验证。,（4）生产过程中使用抗生素时，成品鉴定中应检测抗生素残留量，并规定残留量限制。上述的生产过程包括种子培养活化，发酵，纯化等所有的步骤，所以种子活化阶段是算在生产过程中的。,2015年版药典凡例十六：（3）生产过程中，应尽可能避免使用,试验原理,采用间接竞争,ELISA,方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的卡那霉素将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗卡那霉素抗体，加入酶标二抗后，用,TMB,底物显色，样本吸光值与残留物卡那霉素的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中卡那霉素的含量。,试验原理采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶,操作步骤,1,、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温,(20-25),平衡,30min,以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。,2,、取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放入自封袋，保存于,2-8,。,3,、洗涤工作液在使用前也需回温。,4,、编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做,2,孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。,操作步骤1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温(20-25,5,、加标准品,/,样本：加入标准品,/,样本,20ml,到对应的微孔中，加入酶标二抗,50ml/,孔，再加入抗体工作液,80ml/,孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置,25,避光环境中反应,40min,。,6,、洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液,250ml/,孔，充分洗涤,4,5,次，每次间隔,10s,，用吸水纸拍干。,7,、显色：加入底物液,A,液,50ml/,孔，再加底物液,B,液,50ml/,孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置,25,避光环境中避光反应,15min,。,8,、测定：加入终止液,50ml/,孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于,450nm,处（建议用双波长,450/630nm,检测，在,5min,内读完数据），测定每孔,OD,值。,5、加标准品/样本：加入标准品/样本20ml 到对应的微孔中,定量分析,（,1,）百分吸光率的计算,标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准（,0,标准）的吸光度值，再乘以,100%,，即,百分吸光度值（,%,）,B/B0100%,B,标准溶液或样本溶液的平均吸光度值,B00ppb,标准溶液的平均吸光度值,（,2,）标准曲线的绘制与计算,以标准品百分吸光率为纵坐标，以卡那霉素标准品浓度（,ppb,）的半对数为横坐标，绘制标准