8.3 PCR技术的应用

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,PCR,技术的应用,一,.,聚合酶链式反应,（英文全称：,Polymerase Chain Reaction,）,聚合酶链式反应,简称,PCR,。聚合酶链式反应（,PCR,）是体外酶促合成特异,DNA,片段的一种方法，由,高温,变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的,DNA,得以迅速扩增，具有,特异性,强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于,基因,分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有,DNA,RNA,的地方聚合酶链式反应（,Polymerase Chain Reaction,，简称,PCR,）又称无,细胞,分子克隆或特异性,DNA,序列体外引物定向酶促扩增技术。,8.3.1,聚合酶链反应的原理和操作,（一）工作原理,PCR,的基本工作原理是以拟扩增的,DNA,分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在,DNA,聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成的,DNA,合成。,（二）,PCR,的基本操作,PCR,由,变性,-,退火（复性）,-,延伸,三个基本反应步骤构成：变性，通过加热使模板,DNA,完全变成单链，同时引物自身和引物之间存在的局部双链也得以消除； 退火，将温度下降至适宜温度，使引物与模板,DNA,退火结合；延伸，将温度升高，热稳定,DNA,聚合酶以,dNTP,为底物催化合成新生,DNA,链延伸。,1.,模板,DNA,的变性,，,双链,DNA,的变性温度由其,G+C,含量来决定，模板,DNA,的,G+C,含量越高，熔解温度也越高。一般来说，模板,DNA,经加热至,94 ,左右一定时后，使模板,DNA,双链或经,PCR,扩增形成的双链,DNA,解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。,2.,模板,DNA,与引物的退火,(,复性,),：退火是引物和模板,DNA,复性。复性过程采取的温度（,Ta,）至关重要。复性温度过高，引物不能和模板很好地复性，扩增效率很低。通常，模板,DNA,经加热变性成单链后，温度降至,55,左右，引物与模板,DNA,单链的互补序列配对结合。,3,.,引物的延伸,：,DNA,模板,-,引物结合物在,TapDNA,聚合酶的作用下，以,dNTP,为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板,DNA,链互补的半保留复制链重复循环变性,-,退火,-,延伸三过程，就可,PCR,包括,7,种基本成分：,模板,DNA,、,特异性引物,、,热稳定,、,DNA,聚合酶,、,dNTP,、,二价阳离子,、,缓冲液及一价阳离子,。,获得更多的,“,半保留复制链,”,，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需,2,4,分钟，,2,3,小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。,PCR,扩增仪所需的循环数 取决于反应系统中的模板拷贝数以及引物延伸和扩增的效率。,所以反应最终的,DNA,扩增量可用,Y,(1,X),n,计算。,Y,代表,DNA,片段扩增后的拷贝数，,X,表示平,(Y),均每次的扩增效率，,n,代表循环次数。平均扩增效率的理论值为,100%,，但在实际反应中平均效率达不到理论值。 反应初期，靶序列,DNA,片段的增加呈指数形式，随着,PCR,产物的逐渐积累，被扩增的,DNA,片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期， 即出现,“,停滞效应,”,，这种效应称平台期数、,PCR,扩增效率及,DNA,聚合酶,PCR,的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。,8.3.2 PCR,反应条件,（,一）,PCR,的基本成分,（,二）,PCR,反应条件的选择,PCR,反应条件为,温度、时间,和,循环次数,1.,温度与时间的设置,：基于,PCR,原理三步骤而设置变性,-,退火,-,延伸三温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链,DNA,在,90,95,变性，再迅速冷却至,40,60,，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至,70,75,，在,Taq,DNA,聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因（长度为,100,300bp,时）可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用,94,变性，,65,左右退火与延伸（此温度,Taq,DNA,酶仍有较高的催化活性）。 变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致,PCR,失败的最主要原因 。一般情况下，,93,94lmin,足以使模板,DNA,变性，若低于,93,则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或,PCR,产物完全变性，就会导致,PCR,失败。,退火（复性）温度与时间,：退火温度是影响,PCR,特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至,40,60,，可使引物和模板发生结合。由于模板,DNA,比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于,20,个核苷酸，,G+C,含量约,50%,的引物，,55,为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：,Tm,值（解链温度）,=4,（,G+C,）,2,（,A+T,）,复性温度,=Tm,值,-,（,5,10,）,在,Tm,值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高,PCR,反应的特异性。复性时间一般为,30,60sec,，足以使引物与模板之间完全结合。,延伸温度与时间,：,Taq,DNA,聚合酶的生物学活性：,70,80 150,核苷酸,/S/,酶分子,70 60,核苷酸,/S/,酶分子,55 24,核苷酸,/S/,酶分子,高于,90,时，,DNA,合成几乎不能进行。,PCR,反应的延伸温度,一般选择在,70,75,之间，常用温度为,72,，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。,PCR,延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般,1Kb,以内的,DNA,片段，延伸时间,1min,是足够的。,3,4kb,的靶序列需,3,4min,；扩增,10Kb,需延伸至,15min.,延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。,2.,循环次数,循环次数决定,PCR,扩增程度。,PCR,循环次数主要取决于模板,DNA,的浓度。一般的循环次数选在,30,40,次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。,8.3.3TapDNA,聚合酶和,PCR,扩增的精确性,具有以下特性,（一）,酶活性和热稳定性,（二）,离子依赖性,（三）,忠实性,8.3.4PCR,模板,基因组,DNA,质粒,DNA,噬菌体,DNA,预先扩增的,DNA,cDNA,和,mRNA,等几乎所以形式的,DNA,和,RNA,都可以作为,PCR,反应的模板。,8.3.5PCR,引物,引物是与靶,DNA,的,3,端,和,5,端,特异性结合的寡核苷酸片段，是决定,PCR,特异性的关键。一般来说，引物越长，对靶序列的特异性也越更高。,引物就是为了增幅目的,DNA,而导入的短小,DNA,片断，在,PCR,反应中，新合成的,DNA,是要接在引物上才能继续按照模版,DNA,复制。引物的设计因需要增幅的序列而不同 。,8.3.6PCR,技术在食品检测中的应用,1,. PCR,技术在食品微生物检测中的应用,PCR,技术检测微生物的基本原理是在被检测微生物核酸序列,在,PCR,体系下经高温变性、低温退火、适温延伸三步循环将单个核酸分子序列以,2,的指数进行大量复制扩增的过程。即在检测时,被检测微生物双链,DNA,序列在,94,变性解链成双链, 55,特异性引物与单链,DNA,结合, 72,在引物的引导延伸复制检测微生物,DNA,序列。以上三步进行循环扩增得到大量的被检测微生物,DNA,序列,最后一般在凝胶电泳下检测目的,DNA,。理论上只要样品中有一个分子的微生物就可以在短时间内用,PCR,技术检测到。食品中污染微生物种类很多,即使是同一种食品中微生物种类也有很多,用传统的方法检测食品中微生物要分离出所有的微生物很困难。特别是在检测食品中的弱势菌时,可能很难用传统的方法检测出来,特别是有些微生物很难培养,而用,PCR,技术检测这些微生物可以避免这些问题,因此,利用,PCR,技术能够比较准确地检测食品中微生物。,2. PCR,技术在食品致病菌检测中的应用,传统方法检测食品中致病菌的步骤繁琐费时，需经富集培养、分离培养、形态特征观察、牛理生化反应、血清学鉴定以及必要的动物试验等过程，并且传统方法无法对那些难以人工培养的微生物进行检测。而应用,PCR,技术，只需数小时，就可以电泳法检测出,0,1,mgDNA,中仅含数个拷贝的模板序列；用,PCR,扩增细菌中保守的,rDNA,片，还可对那些人工无法培养的微生物进行检测。利用,PCR,检测食品中的致病菌，首先要富集细菌细胞，通常经离心沉淀、滤膜过滤等方法可从样品中获得细菌细胞，然后裂解细胞，使细胞中的,DNA,释放，纯化后经,PCR,扩增细胞靶,DNA,的特异性序列，最后用电泳法或特异性核酸探针检测扩增的,DNA,序列。,2,1,检测沙门氏菌 沙门氏菌,(Salmonella),是公共卫生学上有重要意义的人畜共患病之一，其病原沙门氏菌属肠杆菌科，蛋、家畜和肉制品是主要传播媒介。传统的检测方法即非选择性和选择性增菌、生长化及血清学鉴定很费力、耗时，需,4,7 h,才能完成，其他如抗体检测法，虽然快速，但其高假阳性使之不适于常规检测。此外，低水平的病原菌污染，食品加工后导致沙门氏菌的“致伤”及食品其他成分的干扰等因素，使得沙门氏菌的检测受到一些限制。,因此，急需一些快速、特异、敏感的检测方法，以及时发现致病菌，控制污染及其可能对人体健康产生的危害。分子生物学技术的发展，使得许多食品微生物学者寻求如,PCR,技术来检测病原菌，以期增加敏感性和显著地减少检测时问。,PCR,技术检测沙门氏菌的特异性,，取决于所选择的扩增靶序列是否为沙门氏菌高度保守的特异性片断，能否忠实地扩增靶序列，由人工合成的一对寡核苷酸引物序列决定。,反之,，引物设计又取决于沙门菌是否具有显著特征的属或种特异性靶序列，显然靶序列的选择和引物的设计是试验成功与否的关键。据目前报导设计的引物来看，基本上是根据沙门氏菌的一段已知序列设计的，并且大多数是根据属特异靶序列设计的。 近年来，用,PCR,技术检测沙门氏菌得到了迅速发展，产生了许多种,PCR,法。如常规,PCR,、套式,PCR,、多重,PCR,。也可几种方法结合使用，将常规,PCR,与半套式,PCR,相结合，根据沙门氏菌中保守的,16,SrRNA,基因为模板设计了一对引物，扩增的片段为,555,bp,。经过优化设计反应条件，只对沙门氏菌产生特异扩增，敏感性达,30,cfu,。,