医学微生物学 实验 脓汁和粪便标本中病原菌检测-6 (4)(精品)

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验器材准备,革兰染色器材准备,医学微生物学实验综合性实验一,脓汁和粪便标本中病原菌的检测（四）,斜面培养物的观察,显微镜油镜的使用,革兰染色法,肉汤接种法,斜面培养物的观察,分别从斜面的正面和背面观察。,从,普通平板,上挑取的黄色或白色菌落接种的斜面，菌苔的颜色，还是原来菌落的颜色，黄色或白色。,从,伊红美蓝,平板上挑取的紫黑色或粉红色菌落接种的斜面，菌苔已经没有原来菌落的颜色。菌苔灰白色、表面湿润、光滑、不透明（紫黑）或半透明（粉红）。,为了讲解方便，以后的实验，仍然,沿用,初次分离得到的菌落的颜色，紫黑色或粉红色。,从斜面上取菌时，不管是涂片，还是接种，每次只取,半个小菌落,大小的菌量；接种环或接种针在培养基表面轻轻刮一下即可。,显微镜油镜的使用,P,13,10,物镜标本位置滴加香柏油,100,油镜浸泡油中,几乎与标本接触（工作距离,0.13mm,）细调节调焦，观察物像记录结果关闭电源。,油镜处理：擦镜纸拭去香柏油 擦镜纸沾少许乙醇和乙醚（,7:3,）混合液擦拭擦镜纸擦拭油镜。,显微镜罩上防尘罩,横放,在实验柜内。,(,顺德校区）实验台两侧的电源插座，只能插入一个插头，请选择离你最近的电源插座。,（校本部）实验台中间，三个位的插座，中间那位插孔没有电，不能使用，只能用两侧的插座。,细菌的显微镜检查法,显微镜：光学显微镜,目镜：,10,倍,物镜：油镜头（,90,或,100,倍）,放大倍数：,10,90,或,100,900,或,1000,镜油：香柏油或石蜡油,香柏油折射率（,n,1.515,），玻片折射率（,n,1.52,），石蜡油（,n,1.46,），空气（,n,1.00,）。,油,镜使用完毕必须擦拭,油,镜头。,100,倍浸油物镜使用方法,油镜放入光路之前，一定要在标本的观察部位上加一滴浸油。,旋转物镜转盘，使油镜进入光路，用微调旋钮对好焦距。,如果浸油内有气泡，会影响观察，可稍微旋转物镜转盘，使油镜来回通过,1,2,次浸油，排除油内气泡。,油,透镜,光线,载玻片,奥林巴斯,CX21,型 生物显微镜,（,实验柜内，,每人一台）,注意：只能横放，不得竖放。,细菌染色法,单染色法：只用一种染料染色，,如美蓝或复红，能清楚观察菌体大小、形态与排列，,不能鉴别细菌。,复染色法（鉴别染色）：采用两种或两种以上的不同染料进行先后染色，可将细菌染成不同的颜色，以便鉴别细菌。,革兰染色,抗酸染色,特殊染色,革兰染色,gram stain,目的要求：,学习并初步掌握革兰染色法。,了解革兰染色法的原理，及其在细菌分类鉴定中的重要性。,革兰染色法是丹麦细菌学家,Christain,Gram,于,1884,年创立的一种细菌染色方法，已有,120,多年的历史，仍在广泛使用，是细菌学中最为经典的染色法,。,革兰染色法原理的三种学说,通透性学说,：,G,+,菌细胞壁结构比较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，酒精不易透入，反而可使细胞壁脱水而形成一道屏障，阻止染料向细胞外渗。,G,-,菌细胞壁比较疏松，肽聚糖层很薄，而外膜、脂蛋白、脂多糖均含有大量脂质，易被酒精溶解，致使细胞壁通透性增高，细胞内的结晶紫,碘复合物容易被酒精脱出。,等电学说,：,G,+,菌等电点,(pH2,3),比,G,-,菌,(pH4,5),低，一般染色时染液的酸碱度在,pH7.0,左右，电离后阳性菌带的负电荷比阴性菌多，因此与带正电荷的结晶紫染料结合牢固，不易脱色。,化学学说,：,G,+,菌细胞内含有某种特殊化学成分，一般认为是核糖核酸镁盐与多糖的复合物，它与染料,媒染剂复合物结合，使已着色的细菌不易脱色。,革兰染色的意义,鉴别细菌：把细菌分成,G,+,和,G,-,两大类。,选择抗菌药物：,G,+,球菌,对青霉素敏感,G,-,杆菌,耐药。,了解细菌的致病机理：,G,+,菌大多产生外毒素,G,-,菌产生内毒素。,革兰染色的步骤,涂片 干燥 固定 染色,加生理盐水,3,4ul,，,2,滴。,菌苔少许（,1mm,小菌落的半量）与盐水混匀，涂成,1cm,2,。,涂毕环移至涂膜,中央侧立，菌膜,破裂,接种环灭菌。,涂片,甲，乙黄色，紫黑。丙，丁白色，粉红。,涂片,干燥,固定,革兰染色法,(gram stain),涂片 干燥 固定,结晶紫 初染,1,分钟水洗,卢戈碘液,媒染,1,分钟水洗,95,乙醇,脱色约,20,秒钟水洗,稀释复红,复染,1,分钟水洗,吸干,镜检。,取菌适量,涂片均匀,水洗轻缓,脱色适当。,影响革兰染色的关键步骤是涂片太厚、脱色困难。,革兰阳性菌,革兰阴性菌,革兰阴性菌,革兰阳性菌,细菌的大小与形态,球菌,coccus,：直径约,1um,。不同种类球菌排列方式不同，有不同的名称。如葡萄球菌、链球菌等。,杆菌,bacillus,：长短粗细很不一致。中等大小的杆菌直径约,1um,，长,2,3um,。,螺形菌,spiral bacteria,：菌体弯曲；一个弯曲为弧菌,(,vibrio,),，菌体长,2,3um,；数个弯曲为螺菌,(,spirillum,),，菌体长,3,6um,。,脓汁标本直接镜检,方法,:,取标本直接涂片,革兰染色镜检。,初步诊断报告,:,“,查见革兰阳性葡萄串状排列球菌，疑似葡萄球菌,”,。,“,查见革兰阳性链状排列球菌，疑似链球菌。,”,甲黄色,乙白色,丙紫黑,丁粉红。,标记：组号，颜色,35,培养,4,6,小时,细菌浓度,1.510,8,/ml,液体培养基接种法,P,10,细菌在液体培养基的生长情况,均匀浑浊：,例如金黄色葡萄球菌,大肠杆菌。,表面生长形成菌膜：,例如枯草杆菌。,沉淀生长：,例如链球菌。,安全警告,本次实验操作，可产生几十至几百个微生物气溶胶颗粒。,气溶胶粒径,100um,沉降很快,50um,在,0.4s,内扩散开,5um,通过呼吸道直接到达肺泡。,Pike,博士对实验室感染统计分析结果发现，不明原因的感染高达,82%,，大多数是气溶胶在空气中扩散引起的。,实验时应坐着，,在酒精灯半径,20,厘米范围内操作，,保持安静、有序，尽量少说话、少走动，以免感染病原菌。,器材准备,油镜的使用,P,13,10,物镜标本位置滴加香柏油,100,油镜浸泡油中,几乎与标本接触（工作距离,0.13mm,）细调节调焦，观察物像记录结果关闭电源 擦镜纸拭去香柏油 擦镜纸沾少许乙醇和乙醚（,7:3,）混合液擦拭擦镜纸擦拭油镜。,革兰染色法,P,15,甲，乙黄色，紫黑。,丙，丁白色，粉红。,肉汤接种法,P,10,甲黄色,乙白色,丙紫黑,丁粉红。,思考题,如何使用油镜,?,革兰染色法的关键步骤是什么,?,为什么,?,染色时为什么通常要用新鲜的细菌培养物,?,实验小结,用普通平板，从浓汁标本中分离得到,黄色,、,白色,两种菌落，这两株细菌，显微镜油镜下均为,G,+,球菌，排列不规则，呈葡萄串状，是典型的葡萄球菌。结合菌落色素，这两株葡萄球菌可能是金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌。,电镜,油镜,葡萄,葡萄球菌三个种的鉴别,试验,金黄色,葡萄球菌,表皮,葡萄球菌,腐生,葡萄球菌,血浆凝固酶,+,-,-,甘露醇发酵,+,-,-,新生霉素敏感性,S,S,R,A,蛋白,+,-,-,注：敏感（,Sensitive S,）,耐药（,Resistant R,）。,用伊红美蓝平板,从粪便标本分离、获得紫黑色和粉红色半透明两种菌落。,紫黑色,菌落是能分解乳糖的非致病菌大肠埃希菌。,粉红色,菌落是,不能分解乳糖的致病菌,。显微镜下，均为,G,-,杆菌，散在排列，从形态上不能鉴别是什么细菌。,电镜,油镜,常用器材摆放顺序：电源插座试管架酒精灯污物盘。,试管架上器材：按接种针、接种环、油性笔和打火机的顺序，分别放置在试管架中间两行，靠近电源插座一侧。,器材使用以后，必须放回原处，依次摆整齐。,革兰染色瓶,染色架,石蜡油,拭镜纸,吸水纸,乙醇乙醚,微生物学公共器材柜,-1,（西侧边台中段）,实验室器材 整齐有序,