分解纤维素的微生物的分离-公开课

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,专题,2:,微生物的培养与应用,课题,2,分解纤维素的微生物的分离,纤维素与纤维素酶,1.,纤维素,纤维素是一种由,葡萄糖,首尾相连而成的,高分子,化合物，是地球含量最丰富的,多糖,类物质。,一、基础知识,植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素。其中,棉花,是自然界中纤维素含量最高的天然产物,。,土壤中某些微生物能够产生纤维素酶,把纤维素分解为葡萄糖，后再利用。,纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，植物每年产生的纤维素超过,70,亿吨，其中,40%-60%,能被土壤中能产生纤维素酶的微生物所利用，不会大量积累。,在草食性动物等的消化道内，也,共生有分解纤维素的微生物,，其原理也是产生纤维素酶而分解纤维素，而人没有分解纤维素的能力。,人类可应用分解纤维素的微生物将秸秆等废弃物转变成酒精，用纤维素酶处理服装面料等。,2.,纤维素酶,纤维素酶是一种,复合酶,，一般认为它,至少包括三种组分,，即,C,1,酶,(,外切酶,),、,C,X,酶,(,内切酶,),和,葡萄糖苷酶,，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。,纤维二糖,C,1,酶、,Cx,酶,葡萄糖苷酶,葡萄糖,纤维素,C,1,酶：,外切酶，从糖链末端开始切掉两个葡萄糖,分子，产生纤维二糖,C,X,酶：,内切酶，使纤维素断裂成片断。,葡萄糖苷酶：,将纤维二糖分解成葡萄糖。,取二支,20mL,的试管,实验：纤维素酶分解纤维素的实验,各加入一张滤纸条,各加入,pH4.8,，物质量为,0.1mol/L,的醋酸醋酸钠缓冲液,11ml,和,10ml,甲 乙,在乙试管中加入,1mL,纤维素酶,两支试管固定在锥形瓶中，放在,140r/min,的摇床上振荡,1h,结果：乙试管的滤纸条消失,讨论：乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是什么？,刚果红染色法,刚果红能与纤维素形成红色复合物,，而不与水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。,（二）纤维素分解菌的筛选,当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成,红色复合物,。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红,-,纤维素的复合物就无法形成，培养基中就会出现,以纤维素分解菌为中心的透明圈,，这样我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。,二、实 验 设 计,土壤取样,选择培养,梯度稀释,将样品涂布在鉴别纤,维素分解菌的培养基上,筛选产生透,明圈的菌落,分布环境,1,、土壤取样：,富含纤维素的环境中,操作步骤,生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境。,原因,实例：树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等。,讨论,:,如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋在土壤中多深？,将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将滤纸埋于深约,10cm,左右的土壤中。,2,、选择培养,增加纤维素分解菌的浓度,，以确保能够从样品中分离所需要的微生物。,目的：,制备选择培养基：,操作：,将土样加入装有,30ml,选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震荡培养,1,2,天，直至培养液变浑浊。也可重复选择培养。,培养基成分分析,培养基组成,提供主要的营养物质,纤维素粉,5g,碳源（能源）,NaNO,3,1g,氮源、无机盐,KCl 0.5g,Na,2,HPO,4,7H,2,O 1.2g,KH,2,PO,4,0.9g MgSO,4,7H,2,O 0.5g,无机盐,酵母膏,0.5g,生长因子、碳源、氮源,水解酵素,0.5g,氮素、生长因子,溶解后，蒸馏水定容至,1000mL,水,提示：自变量为培养基的种类，即普通培养基和选择培养基。可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照,或者将纤维素改为葡萄糖。,A,、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？,是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）,B,、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？,有选择作用，本配方中纤维素作为主要碳源，只有能分解纤维素的微生物可以大量繁殖。,C,、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用,说明：,分析,“,纤维素分解菌的选择培养基配方,”,可知，该配方中的酵母膏也能够提供少量的碳源，因此其他微生物也能在该培养基中生长繁殖。只不过，由于酵母膏的含量极少，因此，只有以纤维素为碳源的微生物才能大量繁殖。,在选择培养的条件下，可以使那些能够,适应,这种营养条件的微生物得到,迅速繁殖,，而那些,不适应,这种营养条件的微生物的繁殖被,抑制,，因此可以起到,“,浓缩,”,的作用。,为什么选择培养能够,“,浓缩,”,所需的微生物？,比较项目,分解尿素的细菌,纤维素分解菌,选,择,培养,基,原理,培养基类型,目的,鉴,定,培养基,原理,现象,方法,将细菌涂布在只有,尿素做氮源的选择,培养基上,将细菌涂布在只有,纤维素粉做碳源的,选择培养基上,固体培养基,液体培养基,筛选菌株,选择培养,思考：本实验的流程与课题,2,中的实验流程有哪些异同？,本实验流程与课题,2,的流程的区别如下。课题,2,是将土样制成的菌悬液直接涂布在,以尿素为唯一氮源的选择性培养基上，直接分离,得到菌落。本课题通过,选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，,再将菌液涂布在选择培养基上。其他步骤基本一致。,按照课题,1,的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释,10,1,10,7,倍。,3.,梯度稀释,10,1,10,2,10,3,10,4,10,5,10,6,4.,将样品涂布到,鉴别纤维素分解菌,的培养基上,（,1,）制备鉴别培养基,:,（,2,）涂布平板：,将稀释度为,10,4,10,6,的菌悬液各取,0.1ml,涂布到平板培养基上，,30,倒置培养。,培养基组成,提供的主要营养物质,CMC-Na 510g,碳源,酵母膏,1g,碳源、氮源、生长因子,KH,2,PO,4,0.25g,无机盐,土豆汁,100mL,碳源、生长因子,琼脂,15g,凝固剂,上述物质溶解后，加蒸馏水定容至,1000mL,氢元素、氧元素,鉴别纤维素分解菌的培养基,(,水溶性羧甲基纤维素钠,),方法一：先,，再加入刚果红进行颜色反应。,方法二：在,时就加入刚果红。,培养微生物,倒平板,5.,刚果红染色法,挑选产生透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。,这两种方法各有哪些优点与不足？,染色法,优点,缺点,方法一,方法二,颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用,操作繁琐,刚果红会使菌落之间发生混杂,操作简便不存在菌落混杂问题,1.,产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈,2.,有些微生物能降解色素，形成明显的透明圈。,比较,项目,分解尿素的细菌,纤维素分解菌,选,择,培养,原理,培养基类型,目的,鉴,定,培养基,原理,现象,方法,在细菌分解尿素的化学反应,中，细菌合成的脲酶将尿素,分解成了氨，氨会使培养基,的碱性增强，,pH,升高。在培养基中加入,酚红指示剂,，如果,pH,升高指示剂会,变红,刚果红,可以与纤维素形成,红色复合物,，当纤维素被,纤维素酶催化分解后红色,复合物无法形成，培养基,上就会出现以纤维素分解,菌为中心的,透明圈,观察菌落周围是否有着色的,环带出现来鉴定尿素分解菌,观察菌落周围是否出现,透明圈来筛选纤维素分解菌,脲酶检测法,刚果红染色法,方法一中,NaCl,溶液的作用？,思考：,漂洗作用,，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免出现的透明圈不够清晰。用这方法可以判断酶活力的大小，实际上刚果红是结合到培养基的多糖底物，但分解纤维素的细菌可以产生纤维素酶，能分解这个多糖底物成为单糖，这样刚果红就不能结合上去了，氯化钠溶液就可以使结合不牢的刚果红洗去，这样就留下大大小小的透明圈，大的透明圈当然分解纤维素的能就强！,在,产生明显的透明圈,的菌落，挑取并接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在,30,0,C,37,0,C,培养，可获得,纯化培养,。,6,、纯化培养,四、结果分析与评价,1.,培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落,对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。,如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。,2.,分离的结果是否一致,由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。,为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行_,_实验，纤维素酶的发酵方法有_ 发酵和_ 发酵。纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的_ 含量进行定量测定。,发酵产纤维素酶,液体,固体,葡萄糖,五、课题延伸,分解,纤维素的微生物的分离,纤维素酶,种类、作用、催化活力,刚果红染色,筛选原理,实验设计,土壤取样,选择培养,涂布培养,纯化培养,前置染色法,后置染色法,富含纤维素土壤,增大分解菌含量,染色鉴别,分离出分解菌,课堂总结,