免疫组化技术常见问题及处理方法-课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,免疫组化技术常见问题及处理方法,免疫组化技术常见问题及处理方法,免疫组织化学的原理,依照抗原抗体反应和化学显色原理,组织切片或细胞标本中的抗原和一抗结合,利用一抗与标记生物素(,HRP,、,AKP,) 、荧光素等的二抗进行反应,通过呈色反应或荧光显示细胞或组织中化学成分,在光学显微镜或荧光显微镜观察确定某些化学成分的分布和含量,免疫组织化学的原理依照抗原抗体反应和化学显色原理,免疫组化技术常见问题及处理方法-课件,免疫组织化学的分类,按标记物质的种类,可分为,酶标记、胶体金标记、荧光标记和放射性标记等,按染色步骤可分为直截了当法(又称一步法)和间接法(二步、三步或多步法)。与直截了当法相比,间接法的灵敏度提高了许多,免疫组织化学的分类按标记物质的种类,可分为酶标记、胶体金标记,按结合方式可分为抗原,-,抗体结合,如过氧化物酶,-,抗过氧化物酶(,PAP,)法;亲和连接,如卵白素,-,生物素,-,过氧化物酶复合物(,ABC,)法、链霉菌抗生物素蛋白,-,过氧化物酶连结(,SP,)法等,SP,法是比较常用的方法;聚合物链接,如即用型二步法,此方法尤其适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测,按结合方式可分为抗原- 抗体结合,如过氧化物酶- 抗过氧化物,可被检测的物质,组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原,如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测,可被检测的物质组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原,如蛋白质、,免疫组织化学的特点,1,)特异性强,2,)敏感性高,3,)定位准确、形态与功能相结合,免疫组织化学的特点 1)特异性强,Western blotting,、,ELISA,与免疫组化的异同,Western blotting,:蛋白质免疫印迹,检查组织或细胞样品内蛋白含量的检测方法,与免疫组化技术相比,定量估计更加准确;也可定性和定位,但敏感性远远低于免疫组化技术,ELISA,:酶联免疫吸附试验,检查体液或组织匀浆中蛋白含量的检测,与免疫组化技术相比,定量最准确,是分泌性蛋白检测首选方法之一,Western blotting、ELISA与免疫组化的异,免疫组织化学方法的基本步骤,组织和细胞的处理,抗原修复,染色,免疫组织化学方法的基本步骤,鼠单克隆抗体或多克隆抗体(兔抗血清),鼠单克隆抗体,特异性较高,背景较干净,有多种潜在用途,但敏感性、亲和力低,兔多克隆抗体(兔抗血清),高敏感性、亲和力,估计有较多的交叉反应,更多的潜在用途,鼠单克隆抗体或多克隆抗体(兔抗血清)鼠单克隆抗体兔多克隆抗体,SP,法,1、,石蜡切片脱蜡和水化后,用,PBS(pH7、4),冲洗,3,次,每次,3,分钟。,2、,依照每一种抗体的要求,对组织抗原进行相应的修复。,3、,每张切片加,1,滴或,50l,过氧化酶阻断溶液,(,试剂,A),室温下孵育,10,分钟,以阻断内源性过氧化物酶的活性。,PBS,冲洗,3,次,每次,3,分钟。,4、,除去,PBS,液,每张切片加,1,滴或,50l,正常非免疫动物血清,(,试剂,B),室温下孵育,10,分钟。,5、,除去血清,每张切片加,1,滴或,50l,的第一抗体,(,用户自选,),室温下孵育,60,分钟或,4,过夜,建议参见每种抗体的说明书。,4,度过夜和从冰箱拿出后,37,度复温,45min,PBS,冲洗,3,次,每次,3,分钟。,SP法1、 石蜡切片脱蜡和水化后,用PBS(pH7、4)冲洗,6、,除去,PBS,液,每张切片加,1,滴或,50l,生物素标记的第二抗体,(,试剂,C),室温下孵育,10,分钟。,PBS,冲洗,3,次,每次,3,分钟。,7、,除去,PBS,液,每张切片加,1,滴或,50l,链霉菌抗生物素,-,过氧化物酶溶液,(,试剂,D),室温下孵育,10,分钟。,PBS,冲洗,3,次,每次,3,分钟。,8、,除去,PBS,液,每张切片加,2,滴或,100l,新鲜配制的,DAB,或,AEC,溶液,显微镜下观察,3-10,分钟。,9、,自来水冲洗,苏木素复染,PBS,或自来水冲洗返蓝。,10、,假如用,DAB,显色,则切片经过梯度酒精脱水干燥,二甲苯透明,中性树胶封固;假如用,AEC,显色,则切片不能经酒精脱水,而直截了当用水性封片剂封片。,6、 除去PBS液,每张切片加1滴或50l生物素标记的第二,二步法,(Envision,系统,),1,),脱蜡、水化组织切片。,2,)依照所应用的一抗的特别要求,对组织切片进行预处理。,3,),0、3%,或,3%H2O2,去离子水孵育,5,分钟,-30,分钟,以阻断内源性过氧化物酶,PBS,或,TBS,冲洗。,4,)滴加一抗,室温或,37,孵育,30-60,分钟,或,4,过夜,PBS,或,TBS,浸洗,3,分钟,5,次。,5,)滴加,enhangcer,增强剂(试剂,A,),37,度,30min,PBS,或,TBS,浸洗,3,分钟,5,次。,6,)滴加通用型,IgG,抗体,-Fab,段,-HRP,多聚体(试剂,B,),室温,37,孵育,30,分钟,-1h,PBS/TBS,冲洗,3,分钟,5,次。,7,)应用,DAB,溶液显色。,8,)蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明、封片。,二步法(Envision系统)1)脱蜡、水化组织切片。,Envision,系统的优点,敏感性高,背景干净(消除内源性生物素的干扰),步骤简单,Envision系统的优点 敏感性高,石蜡切片标本的固定,1,、组织离体后尽快固定,切开固定效果好,2,、固定液以,10,中性福尔马林缓冲液为佳,3,、固定时间在,4h-24h,之间,长时间固定会影响抗原决定簇的暴露,产生阴性结果,4,、固定液的量要超过组织体积,5,倍以上,假如组织固定不及时或不完全固定,HE,染色细胞核发灰模糊,对比不鲜明;免疫组化染色结果不理想,通常组织离体,2h,后抗原完全丢失,石蜡切片标本的固定1、组织离体后尽快固定,切开固定效果好,固定不充分,固定不充分,免疫组化技术常见问题及处理方法-课件,免疫组化技术常见问题及处理方法-课件,免疫组化技术常见问题及处理方法-课件,免疫组化技术常见问题及处理方法-课件,免疫组化技术常见问题及处理方法-课件,免疫组化技术常见问题及处理方法-课件,免疫组化技术常见问题及处理方法-课件,标本的取材、脱水、浸蜡,标本的取材厚度以,2mm,为宜,梯度酒精脱水尽量完全充分,二甲苯透明时间不宜长,1,3h,为佳,透明过度会导致组织发硬发脆,浸蜡应选择低熔点的石蜡,浸蜡应充分,假如组织脱水、浸蜡不充分,蜡块会出现组织收缩凹陷,而且在免疫组化热抗原修复操作时会容易脱片,标本的取材、脱水、浸蜡标本的取材厚度以2mm为宜,标本的切片、捞片、烤片,切片通常以,3,4um,的厚度为宜,太厚易掉片,细胞重叠,对细胞膜阳性结果观察不理想,捞片要求达到无皱折、无气泡,水温宜在(,48,50,),80,烘烤,1,2h,玻片用防脱片或多聚赖氨酸处理,以增强粘附性,标本的切片、捞片、烤片切片通常以34um的厚度为宜,太厚易,冰冻切片的处理,冰冻切片的组织抗原保存好,通常以,5um,的厚度为佳,冷风吹干后用纯丙酮固定,2,遍,干燥置入,4 ,冰箱短期保存,20,冰箱长期干燥保存,缺点是不易做出好的冰冻切片,易出现冰晶、细胞肿胀等现象,冰冻切片的处理冰冻切片的组织抗原保存好,细胞涂片的处理,培养细胞或细胞涂片,应自然晾干后用纯丙酮固定,2,遍,4 ,或,20 ,冰箱保存,细胞涂片的处理培养细胞或细胞涂片,应自然晾干后用纯丙酮固定2,抗原修复,概念,:,应用物理或化学的方法将组织固定过程中封闭的抗原决定簇修复暴露的过程称为抗原修复,原因:,甲醛固定过程中形成醛键和羧甲基而封闭部分抗原决定簇,固定时,蛋白与蛋白之间发生交联,估计会封闭抗原决定簇,抗原修复概念:应用物理或化学的方法将组织固定过程中封闭的抗原,抗原修复的方法,酶消化:,如胰蛋白酶、蛋白水解酶,热抗原修复(,HIER,),:,水浴;微波炉;高压锅;高压消毒锅,;,蒸汽室,超声波,以上综合运用,修复方法从强到弱为:高压修复、微波修复、胰酶修复,抗原修复的方法酶消化: 如胰蛋白酶、蛋白水解酶,热抗原修复,更有效:染色结果更一致,操作更单一,事先确定的热修复时间可适用于几乎所有的组织,一抗能够进一步稀释(节约费用),有些抗体只有采纳热抗原修复才有效,热抗原修复更有效:染色结果更一致,操作更单一,高压锅热抗原修复,比微波更有效,能处理大批量的切片,达到更高的温度,加热均匀(不像微波炉有热点和冷点)和节约时间,高压锅热抗原修复比微波更有效,高压锅热抗原修复,将高压锅中的缓冲液煮开(不加盖),将切片放入沸腾的缓冲液,盖紧盖子和高压阀,加热至全压力,达到全压力后才能计时,最佳时间由各个实验室自行确定-通常在2-4分钟,高压锅热抗原修复将高压锅中的缓冲液煮开(不加盖),热抗原修复:注意事项,不管哪一步都不要让切片干涸(抗原可完全丢失),加热后需要冷却1530分钟(个别未折叠的蛋白链恢复到原来的构型),热抗原修复:注意事项不管哪一步都不要让切片干涸(抗原可完全丢,热抗原修复存在的问题,过度的热修复会导致组织形态的破坏或组织完全消化,免疫染色变弱或定位不准确,有一个时间点,超过这个时间点进一步热修复也可不能获得更强的染色效果,解决方法,:采纳较短时间热修复或酶消化重复实验,热抗原修复存在的问题过度的热修复会导致组织形态的破坏或组织完,修复过度的实验组,修复过度的实验组,修复过度的实验组,修复过度的实验组,修复过度的对比组,修复过度的对比组,修复过度的对比组,修复过度的对比组,酶消化修复,酶消化修复,缩短修复时间,缩短修复时间,热修复抗原会导致内源性生物素反应增强,应用卵白素抗生物素系统会产生假阳性,富含内源性生物素的组织:,肝细胞,线抗体丰富的组织如肾脏、甲状腺、嗜酸细胞等,胞浆丰富的肿瘤细胞,热抗原修复的问题:内源性生物素,热修复抗原会导致内源性生物素反应增强,应用卵白素抗生物,组织在热修复之后,用,3,的新鲜,H,2,O,2,进行封闭, 以阻断内源性过氧化物酶的活性,室温下孵育,10min,再用,10,鸡(鸭)蛋清阻断,10,15,分钟,清洗后滴加一抗,应用非生物素系统的检测试剂盒,如,EnVision,系统,阻断内源性生物素的方法,组织在热修复之后,用3的新鲜H2O2进行封闭, 以阻断,热抗原修复的缓冲液,pH6、0,柠檬酸缓冲液(最常用)、尿素、,Tris-HCl,、,商品化修复液等,碱性,pH,修复液常对绝大多数抗体的效果更好,推荐使用:,EDTA,缓冲液,pH 8、0,或,Tris-EDTA,缓冲液,pH 9、0,是较好的常规修复液,可用于大多数热修复有效的抗体,热抗原修复的缓冲液pH6、0 柠檬酸缓冲液(最常用)、尿素、,抗体孵育条件,主要抗体浓度、温度、时间,三者一般是相互成反比的(相对),浓度是最重要的先决条件,温度决定反应的速度,时间决定反应的量,温度有,4,度、室温、,37,度,其中,4,度最佳,反应最温和,背景较浅;而,37,度反应速度较快,时间较短;室温不太提倡,4,度过夜和从冰箱拿出后需,37,度复温,45min,抗体孵育条件主要抗体浓度、温度、时间,三者一般是相互成反比的,复温的必要性,防止切片从,4,度直截了当放入,PBS,易脱片,使抗原抗体结合更稳定,4,度和,37,度时分子运动方式不同,前者分子碰撞机率和运动速度小于后者,后者结合更快,但敏感性也提高了并易造成非特异染色,复温的必要性防止切片从4度直截了当放入PBS易脱片,脱片产生的原因和如何防止脱片,多聚赖氨酸玻片的质量问题,切片问题:切片较厚或者不均匀,组织本身的问题:癌症组织中坏死组织越多越容易脱片,烤片的时间短、温度不够,操作的时候甩的过猛,有脱片嫌疑的片子最好不甩或轻轻甩,用吸水纸从边缘上慢慢吸水,修复的问题:抗原修复的时候高压时间过长,玻片架放进沸腾的修复液时需轻柔,脱片产生的原因和如何防止脱片多聚赖氨酸玻片的质量问题,背景染色较深的原因,(,1,)抗体浓度过高:一抗浓度过高是常见的原因之一。解决方法是,每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试,使每一抗体个体化,找到适合自己实验室的理想工作浓度,(,2,)抗体孵育时间过长或温度较高:解决方法是,严格执行操作规程,幸免因遗忘而造成时间延长。时间和温度要依照染色结果进行调整,背景染色较深的原因(1)抗体浓度过高:一抗浓度过高是常见的原,(,3,),DAB,变质和显色时间太长:,DAB,最好现用现配,如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的,DAB,不应存放时间太长,DAB,的显色最好在显微镜下监控,达到理想的染色程度时马上终止反应,(,4,)组织变干,(,5,)切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长(大于,24,小时),(,6,)一抗变质、质量差的多克隆抗体,(3)DAB变质和显色时间太长:DAB最好现用现配,如有沉渣,DAB,染色后切片着色呈阴性结果,抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误,抗原修复不全或者不充分,组织切片本身这种抗原含量低,血清封闭时间过长,DAB,孵育时间过短,细胞通透不全,抗体未能充分进入胞内参与反应,DAB染色后切片着色呈阴性结果抗体浓度和质量问题以及抗体来源,DAB,显色时间的掌握,(,1,),DAB,显色时间不是固定的,主要由显微镜下控制显色时间,到出现浅棕色本底时即可冲洗,(,2,)显色时间特别短(如几秒或几十秒)就出现特别深的棕褐色,说明抗体浓度过高或抗体孵育时间过长,需要下调抗体浓度或缩短抗体孵育时间;或前面的封闭非特异性蛋白不全,需要延长封闭时间,(,3,)显色时间特别长(如超过十几分钟)才出现阳性染色,说明抗体浓度过低或孵育时间过短(最好一抗,4,度过夜);或封闭时间过长,DAB显色时间的掌握(1)DAB显色时间不是固定的,主要由显,免疫组化对比和质量控制,阳性对比,阴性对比,免疫组化的标准化,外部质量控制体系,免疫组化对比和质量控制阳性对比,免疫组化技术常见问题及处理方法-课件,免疫组化技术常见问题及处理方法-课件,免疫组化技术常见问题及处理方法-课件,免疫组化技术常见问题及处理方法-课件,免疫组化技术常见问题及处理方法-课件,脱水、透明、封片、拍照,脱水、透明要完全,封片时尽量幸免留有气泡,拍照尽量在两周内,拍照尽量选择干净、清楚的视野,无杂质无破碎组织,所拍照片尽量在同一种状态下,使背景保持一致,照片标识清楚,脱水、透明、封片、拍照脱水、透明要完全,感谢您的聆听！,感谢您的聆听！,