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,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,生物化学实用技术 章宇宁,项目二 蛋白质,蛋白质的研究历史,18,世纪初，人们认识到一类“动物物质”的存在，认为这一类的物质组成了动物（包括人）的身体中柔软的部分,18,世纪末，科学家证明这类物质中含有氮,1838,年，科学家正式将这类物质定名为“,protein,”,该词来自希腊语，有“最重要”的意义,蛋白质的研究历史,科学家对蛋白质的直观认识早于氨基酸,1806,年第一个氨基酸被发现，但直到,1920,年，科学家才区别了必需氨基酸和非必需氨基酸，揭示了氨基酸和蛋白质之间的关系：,蛋白质是由氨基酸构成的,蛋白质的化学组成,蛋白质是由氨基酸构成的,氨基酸中都含有,_,组成蛋白质的主要元素是,_,，有些蛋白质还含有一定量的,_,。,_,元素的含量在各种蛋白质中很接近，平均为,_,。,这是蛋白质元素组成的特点，也是测定蛋白质含量的依据之一。,凯氏定氮法,在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准碱滴定，就可计算出样品中的氮量。,三聚氰胺奶和“皮革奶”,三聚氰胺（,Melamine,）（化学式：,C,3,H,6,N,6,），俗称蛋白精，,IUPAC,命名为“,1,3,5-,三嗪,-2,4,6-,三氨基”，被用作化工原料。它无色，几乎无味，微溶于水（,3.1g/L,常温），可溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等，不溶于丙酮、醚类。,对身体有害，不可用于食品加工或食品添加物。,三聚氰胺中的氮不是来自于蛋白质，可以通过其他技术检测“非蛋白氮”进行定量。,三聚氰胺奶和“皮革奶”,在皮革行业中，会有一些下脚料。它们是没有用的废料，但含有大量胶原蛋白。,用这样的废料来生产“,水解胶原蛋白,”，成本非常低,由于加工过程的卫生条件差、有毒重金属残留，造成严重危害,，“皮革奶”的检测并不困难。胶原蛋白中有大量的,羟基脯氨酸,，而牛奶蛋白中并不含有；牛奶蛋白中有一定量的,色氨酸,，而胶原蛋白中并不含有。,蛋白质的分类,按分子形状分类,球状蛋白,纤维状蛋白,按分子组成分类,简单蛋白：,无 非蛋白成分,可进一步按溶解度分类,结合蛋白：,蛋白质非蛋白成分,可进一步按辅基分类,蛋白质的分类,简单蛋白按溶解度分类,蛋白质的分类,结合蛋白按辅基分类,氨基酸如何形成蛋白质？,如何“串起”氨基酸？,氨基酸如何形成蛋白质？,氨基酸,脱水缩合,形成,肽,作业一：抄写氨基酸脱水缩合形成肽的方程式,氨基酸如何形成蛋白质？,肽键：不能自由旋转，,C,、,N,、,O,、,H,及两边的,C,原子,6,个原子共平面，称为“酰胺面”，影响蛋白质结构,两个氨基酸相连就叫做二肽,二肽的两端可以继续和其他氨基酸反应，形成三肽、四肽、五肽,少于10个氨基酸的肽叫,寡肽,，,多于10个氨基酸的肽叫,多肽,某些小肽具有特别的生物活性,肽及肽键,氨基酸残基,蛋白质的理化性质,物理性质千差万别,由氨基酸组成，保留了氨基酸的一些化学性质,具有本身的独特性质,蛋白质的理化性质,两性性质及等电点,胶体性质,沉淀作用,颜色反应,紫外吸收性质,蛋白质的两性性质及等电点,蛋白质的等电点：,蛋白质所带,净电荷,为零时，所处溶液的,pH,值即为该蛋白质的等电点,。,等电点与等离子点,中性盐的存在常导致蛋白质的等电点发生明显的改变,实际测得的等电点与介质的离子组成有关,在,不含任何盐的纯水,中测得的等电点称为,蛋白质的等离子点,，是蛋白质的特征常数,蛋白质的胶体性质,蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如不能通过半透膜等。,常用,透析法,分离纯化蛋白质,稳定蛋白质胶体溶液的主要因素：,蛋白质表面极性基团形成的,水膜,(,水化层,),将蛋白质颗粒彼此隔开，阻止其相互聚集而沉淀,蛋白质颗粒在非等电状态下，带,同种电荷,，互相排斥，不致聚集而沉淀,蛋白质的沉淀作用,1,、定义：,蛋白质的水膜或电荷一旦除去，蛋白质就会从溶液中沉淀下来,2,、分类：,可逆沉淀,：在沉淀过程中，蛋白质的结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液。,不可逆沉淀,：在沉淀过程中，蛋白质的结构和性质都发生了变化，沉淀不可能再重新溶解于水,作业二：使蛋白质可逆沉淀和不可逆沉淀的常用方法都有哪些？,可逆沉淀蛋白质的常用方法,：, 盐析法,(,中性盐沉淀法,),盐析法,(,中性盐沉淀法,),：,向蛋白质溶液中加入,大量,的中性盐,使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。常用中性盐有(,NH,4,),2,SO,4,、Na,2,SO,4,、NaCl,等。,盐溶：,向蛋白质水溶液中加入,少量,的中性盐，增加蛋白质表面的电荷，增强了蛋白质与水的作用，从而导致蛋白质在水中的溶解度增大, 有机溶剂沉淀法：,常用与水互溶的有机溶剂如,甲醇、乙醇、丙酮等，破坏水膜，使其沉淀。,重金属盐沉淀法,常用重金属盐有,Hg,2+,盐、,Pb,2+,盐、,Cu,2+,盐等,生物碱试剂沉淀法,常用生物碱试剂如单宁酸、苦味酸、钨酸等,不可逆沉淀蛋白质的常用方法：,蛋白质的颜色反应,反应 试剂 颜色 反应基团,双缩脲反应,NaOH,稀,CuSO,4,紫红 2个或2个以上肽键,Folin,酚试剂反应,CuSO,4,磷钨酸-钼酸 兰色 酚基,茚三酮反应 茚三酮 兰紫色 游离氨基,Millon,反应,Millon,试剂 红色 酚基,黄色反应,HNO,3,及,NH,3,黄、橘黄 苯环,乙醛酸反应 乙醛酸，,H,2,SO,4,紫红 色氨酸吲哚基,坂口反应 次氯酸钠,萘酚,NaOH,红色 精氨酸的胍基,双缩脲反应,蛋白质也有类似反应,红紫色络合物,(碱性溶液),Cu,2+,蛋白质的紫外吸收,大部分蛋白质均含有芳香族氨基酸。,_,、,_,、,_,芳香族氨基酸在280,nm,附近有最大吸收，绝大多数蛋白质也有同样的性质,。,可以对蛋白质进行定性定量测定。,蛋白质的结构,蛋白质的结构,基本结构：,一级结构,三维结构：高级结构,二级结构,超二级结构,结构域,三级结构,四级结构,一级结构决定高级结构，高级结构决定功能,蛋白质的结构,蛋白质的一级结构,1,、定义：,指蛋白质分子中氨基酸的排列顺序和连接方式,，它是实现蛋白质空间结构及其功能的基础，又称为蛋白质的,化学结构,、,共价结构,、,初级结构,作业三：蛋白质一级结构的定义是什么？,蛋白质一级结构举例,牛胰核糖核酸酶,50年代末,Moore,等,牛胰岛素,1953,年,sanger,等,确定蛋白质一级结构的方法,将肽链部分水解，生成的碎片（二肽、三肽等）用末端残基分析法加以测定。当有足够的小碎片被鉴定后，就有可能求出整个链中残基的顺序了。,1.4.3,蛋白质的二级结构,1,、,定义：,指蛋白质多肽链主链的空间走向（折叠和盘绕方式）,2,、四种二级结构单元,-,螺旋,-,折叠,-,转角,不规则卷曲,作业四：常见的蛋白质二级结构有哪几种？,-,螺旋,俯视图,侧视图,-,螺旋的特征要点：,有右手螺旋及左手螺旋两种，天然蛋白质中的,-,螺旋几乎都是,右手螺旋,，右手螺旋比左手的稳定,稳定性是靠,链内氢键,维持的，肽链上,C=O,氧与它后面第4个残基上的,N-H,氢之间形成氢键，氢键的取向几乎与中心轴平行,每圈螺旋高度为0.54,nm,，含3.6个氨基酸残基；每个氨基酸残基绕轴旋转100,，沿轴上升0.15,nm,氨基酸残基的,R,侧链在螺旋的外侧，其形状、大小及电荷等均影响,-,螺旋的形成,-,折叠,定义：,两条或多条几乎完全伸展的多肽链侧向聚集在一起，靠链间氢键联结的片层结构,折叠的特征要点：,相邻肽链走向可,平行,也可,反平行,。肽链的,N-,端在同侧为平行式，不在同侧为反平行式。从能量角度考虑反平行式更为稳定,稳定性是靠,链间氢键,维持的，氢键是由相邻肽链主链上的,N-H,和,C=O,之间形成的,氨基酸残基的,R,侧链交替分布在片层的上下两侧,-,转角,(,-,回折、,-,弯曲、发夹结构,),定义：,是蛋白质分子中出现的180,回折。,-,转角的特征要点,：,主链骨架以180,返回折叠,由多肽链上4个连续的氨基酸残基组成，第1个氨基酸残基的,C=O,与第4个氨基酸残基的,N-H,之间生成氢键,广泛存在于球状蛋白质中，多数由亲水氨基酸残基组成,无规则卷曲,定义：,没有规律的多肽链主链骨架构象,此结构看来杂乱无章，但对一种特定蛋白又是确定的，而不是随意的。,酶的活性中心往往在无规则卷曲中。,1.4.4,超二级结构：,若干相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成有规则，在空间上能辨认的二级结构组合体。,1.4.5,结构域：,多肽链上由相邻的超二级结构单元联系而成的局部性区域，多肽链,折叠成近乎球状的高级结构。,补充：,1.4 .6,蛋白质的三级结构,定义：,建立在二级结构、超二级结构乃至结构域的基础上，,一条多肽链中,所有氨基酸残基的空间关系,（构象）,。,举例：肌红蛋白,肌红蛋白1条多肽链1个血红素辅基,结构域三级结构,？,对于小分子蛋白质来说，结构域就是其三级结构；,大分子蛋白质则是由两个或两个以上相对独立的三维实体（结构域）缔合而成的。,典型例子：,免疫球蛋白,木瓜蛋白酶内的2个结构域,彼此很不相同,弹性蛋白酶,的二个结构域,彼此非常相似,1.4.7,蛋白质的四级结构,1,、定义：,由两条或两条以上各自独立具有三级结构的多肽链,通过次级键,相互缔合而成的蛋白质结构,四级结构只存在于,具有两条或以上肽链,组成的蛋白质中,。,亚基（亚单位）：,四级结构的蛋白质中每一个球状蛋白。,单体蛋白质：,只有一个亚基（三级结构）,寡聚蛋白质：,由少量亚基组成的蛋白质，如四聚体血红蛋白,多聚蛋白质：,由大量亚基组成的蛋白质,举例：血红蛋白,1.4.8,维系蛋白质分子结构的作用力,共价键：,肽键、二硫键,非共价键：,氢键、离子键、疏水键、范德华力,二硫键,(,二硫桥,),是由两个半胱氨酸侧链的巯基,SH,脱氢而形成的。,二硫键用于稳定蛋白质的三、四级高级构象。,氢键,多肽链中侧链间或侧链与主链骨架间所生成的氢键是维持蛋白质三、四级结构所需的,多肽链中主链骨架中的氢键是维持蛋白质二级结构主要的次级键,疏水键,(,疏水作用力,),蛋白质中的疏水氨基酸残基避开水分子而聚集在分子内部的趋向力。,它是维持蛋白质分子三、四级结构最主要的作用力。,离子键,(,盐键,),正、负电荷的侧链基团之间的一种静电吸引作用。,范德华力,中性分子或中性原子之间弱的作用力，参与维持蛋白质分子三、四级结构,作业五,维持蛋白质一,四级结构的主要作用力分别是什么？,
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