第6章目的基因的分离克隆(植物基因工程)课件

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,11/7/2009,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第六章,目的基因的分离克隆,.,第六章.,基因工程的步骤,.,基因工程的步骤.,把需要研究的基因称为目的基因,为使优良性状聚集于同一生物体，,在生物群体中分离编码蛋白的结构基因，并在此基础上创造出有价值的新物种。,生物界的长期进化积累了大量对人类有用的基因，这是一个宝贵的资源。,目的基因,.,把需要研究的基因称为目的基因目的基因.,第一节 克隆的概念,克隆,(clone),来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。,获取同一拷贝的过程称为克隆化,(cloning),，即,无性繁殖,。,名词：无性繁殖系,动词：形成,DNA,分子、细胞或个体的无性繁殖系的过程,形容词：克隆的,载体,.,第一节 克隆的概念 克隆(clone,植物转化,.,植物转化.,组织培养,幼苗克隆,.,组织培养幼苗克隆.,.,.,第二节,目的基因的克隆方法,1,、转录水平的克隆,2,、基因组水平上的克隆,3,、蛋白质组水平的克隆,.,第二节1、转录水平的克隆.,（,1,）相关概念及,cDNA,文库,基因的差别表达,:,生物个体发育的不同阶段、或在不同的组织器官中、或在不同的环境条件下发生的不同基因按一定时间和空间有序表达的方式称为基因的差别表达。,1,、转录水平的克隆,.,（1）相关概念及cDNA文库1、转录水平的克隆.,cDNA,文库,(Complementary DNA library),以组织细胞中的,mRNA,为模板，反转录合成双链,cDNA,，各,cDNA,分子分别插入载体形成重组子，再导入宿主细胞克隆扩增。这些在重组体内的,cDNA,的集合即,cDNA,文库。,.,cDNA文库.,分为六个阶段：,阶段,1,：,mRNA,反转录酶催化合成,cDNA,第一链,阶段,2,：,cDNA,第二链的合成,阶段,3,：,cDNA,的甲基化,阶段,4,：接头或衔接子的连接,阶段,5,：纯化,cDNA,阶段,6,：,cDNA,与,噬菌体臂的连接,cDNA,文库的构建步骤,.,分为六个阶段：cDNA文库的构建步骤.,以,mRNA,为模板，经反转录酶合成互补,DNA(cDNA),，构建的基因库。,绝大多数真核生物,mRNA,的,3,端具有一段多聚,A(poly-A),尾端序列。在反转录酶作用下，用,poly-T,引物,(primer),，引导合成一条互补,DNA,，即第一条,DNA,链，形成,RNA-DNA,杂合双链。然后合成第,2,条链。,cDNA,文库筛选的优点,cDNA,文库仅包含正在表达的基因,不同物种、不同组织的,cDNA,文库不相同,基因总量少，易筛选,.,以mRNA为模板，经反转录酶合成互补DNA(cDNA),.,.,.,.,（,2,）如何从,cDNA,文库中找到所需要的基因？,.,（2）如何从cDNA文库中找到所需要的基因？.,转录水平上的基因克隆方法,差别杂交筛选,扣除杂交,代表性差别分析,差异显示,cDNA,阵列杂交,基因表达系列分析,抑制差减杂交,.,转录水平上的基因克隆方法差别杂交筛选.,差别杂交筛选,含有表达,目的基因,不含有表,达目的基因,提取分离,cDNA,探针,提取分离,cDNA,探针,cDNA,文库,铺平板,转膜,转膜,比较,分析,用对照样品,cDNA,作探针杂交的光片中没有而在检测样品,cDNA,作探针杂交的光片中有的印斑，可对照光片从原平板挑出菌落进行鉴定是否含有目的基因,.,差别杂交筛选含有表达不含有表提取分离cDNA提取分离cDNA,.,.,扣除杂交,检测方,mRNA,来源相似,而功能有,异的两种,样品,反转录为,cDNA,过量,(10,倍,),的驱动方,mRNA,进,行杂交,经过柱或其他方,法去掉双链杂合体,富集目的基因,构建扣除,cDNA,文库,筛选目的基因,.,扣除杂交检测方来源相似反转录为过量(10倍)经过柱或其他方富,差别显示技术,.,差别显示技术.,根据生物大分子间的相互作用分离目的,cDNA,克隆,酵母双杂合系统,真核生物的位点特异转录激活因子：,BD AD,.,根据生物大分子间的相互作用分离目的cDNA克隆酵母双杂合系统,.,.,基于,EST,信息的基因克隆,EST,.,基于EST信息的基因克隆EST.,由杨树,EST,库获得基因序列,PCNA,.,由杨树EST库获得基因序列PCNA.,克隆的核酸酶,.,克隆的核酸酶.,.,.,2,、基因组水平上的克隆,将所有的遗传物质克隆到细菌中,-DNA,文库,基因组文库,(gene library),：将某种生物的基因组,DNA,切割成一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞，进行克隆。这些存在于所有重组体内的基因组,DNA,片段的集合，即基因组文库，它包含了该生物的所有基因。,通常的方法是，尽量提取大分子量的核,DNA,，用限制性酶酶切后，分离选择具有一定长度,(,大于,15kb),的,DNA,片段，与适宜的载体连接构成重组,DNA,分子,选择相应的宿主细胞用于克隆。载体可以是质粒，噬菌体，,BAC,或,YAC,等,.,2、基因组水平上的克隆将所有的遗传物质克隆到细菌中-D,文库构建流程,抽提基因组,DNA,鸟枪法制备,DNA,片段,DNA,片段与载体重组,转化宿主菌,筛选目的基因（核酸探针法、免疫结合法）,.,文库构建流程抽提基因组DNA鸟枪法制备DNA片段DNA片段与,.,.,理想的核基因库应当能包括全部的基因组序列。如果每一个克隆包括的,DNA,片段大，则总克隆数目少，常选择能接受较大片段的载体。,检测是否包括一个完整的基因组序列的公式：,例,:,人类基因组,3.0 x10,6,kb,以,EMBL,作载体，插入片段的平均长度为,17 kb,，,p,为,99%,时,基因库应有,8.1x10,5,个,重组噬菌体。,.,理想的核基因库应当能包括全部的基因组序列。如果每一个克隆包,从基因库中筛选、分离基因，可根据对待选基因相关信息的了解程度，确定筛选方法和条件。,常用方法是利用一段核苷酸序列,(DNA,，,cDNA,或寡核苷酸,),作探针,(probe),，用放射性同位素或非放射性同位素标记探针，也可用抗体作探针，筛选基因库。,（,1,）基于基因文库的基因克隆,.,从基因库中筛选、分离基因，可根据对待选基因相关信息的了解程,菌落杂交技术寻找目标,DNA,克隆,.,菌落杂交技术寻找目标DNA克隆.,文库的抗体筛选,.,文库的抗体筛选.,（,2,）,T-DNA,标签克隆基因,基本原理：,利用,T-DNA,插入突变创造突变体，获得各突变体的纯合材料；,然后分析突变性状与,T-DNA,的共分离关系，存在共分离的材料用适当的,PCR,克隆技术获得,T-DNA,的侧翼基因组序列；,用其作探针筛选基因文库，获取目标基因或克隆，再进行下一步的分析。,.,（2）T-DNA标签克隆基因基本原理：.,T-DNA,载体构建,转化植物（,T1,，,T-DNA,杂合子,),收获,T2,种子,筛选,T2,，获突变子，应为,3:1,分离,确定,T-DNA,与突变型共分离的个体,产生纯合后代,克隆,T-DNA,两侧的植物,DNA,利用侧翼,DNA,序列作探针从该植物的,cDNA,文库中钓取基因,基因功能的验证,.,T-DNA 载体构建.,（,3,）,图位克隆,又叫,(,或候选基因克隆,),是根据目的基因的位置特性而非其编码产物来克隆。成功分离目的基因须具备三个必要条件：,分子标记,高密度遗传图谱,染色体步移法分离目的基因,.,（3）图位克隆又叫(或候选基因克隆),是根据目的基因的位,高密度遗传学图谱,.,高密度遗传学图谱.,.,.,.,.,4,、,PCR,克隆,基于,PCR,的,DNA,克隆与基于载体的克隆技术相比具有一定优越性。,PCR,反应速度很快，可以在几个小时内完成，而载体克隆需要几周时间,。,PCR,反应非常灵敏，可以用来扩增痕量样品的,DNA,。,对于部分降解、甚至污染，用载体克隆无法进行的,DNA,样品，,PCR,扩增仍可获得目的基因克隆,.,4、PCR克隆基于PCR的DNA克隆与基于载体的克隆技术相,（,1,）套式,PCR,（,2,）反向,PCR,（,3,）不对称,PCR,（,4,）锚定,PCR,（,5,）长程,PCR,（,6,）反转录,PCR,（,7,）锅柄,PCR,.,（1）套式PCR.,Bt886Cry3Aa,基因的克隆,F-2k,：,5 ATG ATA AGA AAG GGA GGA AGA 3,R-2k,：,5 TTA ATT CAC TGG AAT AAA TTC 3,质粒提取,基因扩增,.,Bt886Cry3Aa基因的克隆F-2k：5 ATG AT,序列分析,.,序列分析.,5,、人工合成基因,根据已知的基因或氨基酸序列，将化学合成寡核苷酸的方法与酶促合成,DNA,的方法结合起来，可以很快地人工合成基因。,磷酸二酯法,亚磷酸三酯法,寡核苷酸连接法,.,5、人工合成基因 根据已知的基因或氨基酸序列，将化学合成,5,、人工合成基因,例如，首先化学合成多个含有,80-100,个核苷酸的寡核苷酸,，每个寡核苷酸之间具有,19-24,个核苷酸的重叠序列,，再将各个寡核苷酸等量混合，在,DNA,聚合酶,(,或,Taq,酶,),作用下，各寡核苷酸又作为引物合成新链，使单链部分补齐成为双链，再用两个,PCR,引物，经,PCR,扩增出,DNA,片段。若将两个,DNA,片段放在一起，,经,SOE-PCR(sequence overlapped extension,，,SOE),扩增出完整的基因片段。,.,5、人工合成基因 例如，首先化学合成多个含有80-100,.,.,.,.,限制化学法合成基因的因素,已知序列且有应用价值的基因很少，而植物来源,的基因更少；,化学合成的寡核苷酸片段长度有限，经基因组装,才能合成较大的目的基因，而这往往使基因制备,难度加大；,化学基因合成相比之下比较昂贵。,.,限制化学法合成基因的因素.,植物转化,培养基,卡那霉素,.,植物转化培养基卡那霉素.,