蛋白质免疫印迹技术和常见问题课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,免疫印迹技术的基础,-,免疫反应,免疫测定,(immunoassay),利用抗原抗体,反应来测定标本中抗原或抗体的方法,检测对象：具体免疫活性的物质,反应特性：高度的特异性和敏感性,免疫印迹技术的基础-免疫反应 免疫测定(immunoassa,Western Blot,原理简介,Western Blot,一般流程,Western Blot,常见问题分析,内容概要,Western Blot原理简介内容概要,在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。,Western Blot,原理,在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支,目的蛋白的表达特性分析,目的蛋白与其它蛋白的互作,目的蛋白的组织定位,目的蛋白的表达量分析,Western Blot,的应用,目的蛋白的表达特性分析Western Blot 的应用,Western Blot,原理简介,Western Blot,一般流程,Western Blot,常见问题分析,内容概要,Western Blot原理简介内容概要,Western Blot,流程,蛋白样品的制备,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜,封闭,一抗杂交,二抗杂交,底物显色,Western Blot 流程蛋白样品的制备转膜,通过水溶法或有机溶剂制备总蛋白,水溶液提取法,针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂。,有机溶剂提取法,对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括,乙醇、丙酮和丁醇等。,通过层析或电洗脱法制备目的蛋白,蛋白样品的制备,通过水溶法或有机溶剂制备总蛋白蛋白样品的制备,蛋白样品的定量,Bradford,法,考马斯亮蓝,G-250,有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，与蛋白结合后形成蓝色化合物，该化合物在,595nm,处有最大吸收值，化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比。,TIANGEN,产品,Bradford,蛋白质定量试剂盒,蛋白样品的定量Bradford法,不连续的电泳缓冲体系。,SDS,蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小,。,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳,不连续的电泳缓冲体系。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,凝胶成分,N,N,-,亚甲双丙烯酰胺和丙烯酰胺,SDS,配胶的,Tris,缓冲液,TEMED,过硫酸铵,Tris-,甘氨酸电泳缓冲液,凝胶成分N,N-亚甲双丙烯酰胺和丙烯酰胺,凝胶浓度与蛋白分离范围,凝胶浓度（）,线性分离范围（,KD),15,12-43,10,16-68,7.5,36-94,5.0,57-212,凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度（）线性分离范围（KD)15,转膜,膜的选择,尼龙膜,硝酸纤,维素膜,封闭非特异性抗体结合麻烦,简单快速封闭非特异性抗体结合,价格昂贵,价格便宜,特殊要求下的选择,需要更高的蛋白结合率,（尼龙膜：,480g/cm,2,；硝酸纤维素膜：,80g/cm,2,）,目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱,需要更大的机械强度,转膜膜的选择尼龙膜硝酸纤封闭非特异性抗体结合麻烦简单快速封闭,湿法,将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中，电转,45min,或过夜。,半干法,将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间，电转,10,30min,。,转膜方法,湿法转膜方法,丽春红,S,染色,蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤,维素滤膜，换水几次。,印度墨汁染色,只用于放射性标记抗体或放射性标记,A,蛋白探,针的,Western,印迹过程。,转膜后检测,丽春红S染色转膜后检测,转膜后的封闭,脱脂奶粉,BSA,Western Blot,膜封闭液,（生物试剂公司提供）,把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤膜面积以,0.1ml/cm2,的量加入封闭剂，摇床上平缓摇动，于室温温育,1-2,小时。倒掉缓冲液，立即加入一抗溶液与滤膜温育。,转膜后的封闭脱脂奶粉 把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或,一抗用量也根据,0.1ml/cm,2,来计算，室温,1-2,小时。,倒掉一抗溶液，用,250ml PBS,漂洗液滤膜,3,次，每次,10min,。,加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，室温温育,1-2,小时。,一抗、二抗孵育,一抗用量也根据0.1ml/cm2来计算，室温1-2小时,二抗与底物反应显色,辣根过氧化物酶法,碱性磷酸酶法,化学发光显色法,Anti,His,二抗与底物反应显色辣根过氧化物酶法AntiHis,应用举例：用,Western blot,检测患者,血清中的,HIV,病毒抗体,Step1,：经电泳将,HIV,混合抗原按分子量大小分离,Step2,：印迹转移已分离的抗原至硝酸纤维膜上，封闭,Step3,：加入待检病人血清，漂洗,Step4,：加入合适的、标记的二抗（,HRP,或,AP,），漂洗,Step5,：加入显色底物（或放射自显影），显色检测,应用举例：用Western blot检测患者Step1：经电,Western Blot,原理简介,Western Blot,一般流程,Western Blot,常见问题分析,内容概要,Western Blot原理简介内容概要,Western blot,常见问题,SDS-PAGE,电泳,胶不平？,凝胶漏液？,胶板洗刷干净,加入,AP,和,TEMED,的量要合适,加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀,温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀,两块玻璃板底部要对齐,Q,A,Western blot常见问题SDS-PAGE电泳胶不平,条带比正常的窄？,“,微笑,”,或,“,倒微笑,”,条带？,凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓,拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲,样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度,胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适,Western blot,常见问题,SDS-PAGE,电泳,Q,A,条带比正常的窄？凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻,凝胶肿胀或卷曲？,条带歪斜或漂移？,单个或多个白点？,转膜缓冲液过热,？,可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡,5-10min,电转仪长期使用导致海绵变薄，,“,三明治,”,结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的纸片,确保膜和胶块之间没有气泡,缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温,Western blot,常见问题,转膜及抗体检测,Q,A,凝胶肿胀或卷曲？可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-1,蛋白分子量,10KD,蛋白的等电点,=8,SDS,浓度不合适,凝胶太厚,蛋白分子量,10KD,时，减少转膜时间；使用小孔径的膜,更换高,pH,值,Buffer,在阴极,buffer,中加入,0.005-0.01%SDS,可提高转膜效率,延长转膜时间,Western blot,常见问题,蛋白转膜效率低,A,R,蛋白分子量 10KD蛋白分子量10KD时，减少转膜时间；,膜没有均匀浸湿,膜或者缓冲液污染,封闭不充分,抗体与封闭剂出现交叉反应,抗体浓度过高,转膜前用,100%,甲醇将膜完全浸湿,拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液,检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应,杂交前检测一抗、二抗的工作浓度,A,R,Western blot,常见问题,显色背景高,膜没有均匀浸湿转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿ARWeste,抗体保存不当,抗原不充足,膜的漂洗过度,抗体长期保存应在,70,，使用前做效价检测,增加蛋白上样量，做已知标准量蛋白的对照,减少漂洗的时间和次数,Western blot,常见问题,杂交信号弱,A,R,抗体保存不当抗体长期保存应在70，使用前做效价检测Wes,一抗不是唯一特异的,二抗出现非特异结合,制备单克隆抗体或者重新选取合成抗原多肽的位点,设立不加一抗，只加二抗的平行对照来检测二抗是否有非特异结合,A,R,Western blot,常见问题,显现非特异性条带,一抗不是唯一特异的制备单克隆抗体或者重新选取合成抗原多肽的位,分子量,Marker,：确定蛋白条带的分子量,已知量标准产物的正对照,空白载体对照：如果是表达蛋白需要做表达前的,内参：看家基因编码表达的蛋白,参照体系,分子量Marker：确定蛋白条带的分子量参照体系,TIANGEN,产品结构,底物显色液,AP,底物显色试剂,BCIP/NBT,底物显色试剂盒,HRP,底物显色液,HRP-DAB,底物显色试剂盒,增强型,HRP-DAB,底物显色试剂盒,沉淀型单组分,TMB,底物溶液,可溶型单组分,TMB,底物溶液,Pro-light HRP,化学发光检测试剂,TIANGEN产品结构底物显色液 AP底物显色试剂BCIP,HRP-DAB,底物显色试剂盒,Western blot,中的应用,HRP-DAB,底物显色试剂盒免疫组化中的应用,HRP-DAB,底物显色试剂盒应用,HRP-DAB底物显色试剂盒Western blot中的应用,Pro-light HRP,灵敏度检测试验,Pro,Light HRP,化学发光,试剂盒检测结果,Pro-light HRP 灵敏度检测试验ProLight,Toll-free:800-810-2177,TIANGEN BIOTECH,（,BEIJING,）,CO.,LTD.,Toll-free:800-810-2177 TIANG,