T细胞免疫功能检测平台的建立和应用课件_2

,单击此处编辑母版标题样式,.,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,二级,三级,四级,五级,.,*,T细胞免疫功能检测平台的建立与临床应用,北京协和医院感染内科,.,T细胞免疫功能检测平台的建立与临床应用北京协和医院感染内科.,T细胞免疫功能与感染,T细胞免疫功能的抗感染作用,正常人的免疫功能,T细胞免疫的抗感染作用,T细胞免疫功能的测定,T细胞亚群,T细胞功能,T细胞免疫功能测定的临床意义,.,T细胞免疫功能与感染T细胞免疫功能的抗感染作用.,.,.,机体的免疫系统,非特异免疫,皮肤粘膜，吞噬细胞，NK细胞，,补体，正常菌群,特异性免疫,细胞免疫：CD4+细胞，CD8+细胞,体液免疫：B细胞,.,机体的免疫系统非特异免疫.,机体的免疫系统,CD4,细胞,非特异性免疫,特异性免疫,NK细胞，吞噬细胞,B细胞,CD8细胞,.,机体的免疫系统CD4细胞非特异性免疫特异性免疫NK细胞，吞噬,CD4+细胞的免疫中枢指挥功能,.,CD4+细胞的免疫中枢指挥功能.,CD4+细胞的免疫中枢指挥功能,.,CD4+细胞的免疫中枢指挥功能.,CD4+细胞的产生和分群,记忆 CD4,胸腺,纯真 CD4,Net Naive CD4#5x10,7,/天,抗原,.,CD4+细胞的产生和分群记忆 CD4胸腺纯真 CD4Net,纯真,纯真和记忆/效应4细胞亚群的产生,记忆,效应,凋亡,胸腺,效应,效应,效应,.,纯真 纯真和记忆/效应4细胞亚群的产生记忆效应凋亡胸腺,纯真 CD4和记忆CD4细胞,.,纯真 CD4和记忆CD4细胞.,纯真/记忆,CD+,细胞分泌不同的介素,.,纯真/记忆CD+细胞分泌不同的介素.,细胞免疫功能的抗感染作用,感染发生的两个基本要素：病原体和机体免疫功能,免疫功能对疾病转归的影响：,对免疫功能正常的人不起致病作用的病原体，在免疫功能低下的人身上可发生致命性的感染；,免疫功能正常的人发生某种感染后可很快恢复，而在免疫功能紊乱的人则成为慢性状态；,对同样的病原体所导致的感染，给予同样的抗感染治疗，转归完全不一样,.,细胞免疫功能的抗感染作用感染发生的两个基本要素：病原体和机体,细胞免疫功能的抗感染作用,为什么？,乙肝病毒感染：,有人为乙肝病毒携带者,也有人成为慢性乙肝病人？,HPV感染：,多数人表现为无症状的HPV潜伏感染者，少数人表现为复发性HPV,CMV感染:,90%的正常人隐性感染终生带病毒，但免疫功能低下时可致死？,.,细胞免疫功能的抗感染作用为什么？.,.,.,HIV感染的自然史,CD4细胞,(cell/mm3）,800,400,急性感染期,无症状期,艾滋病前期和艾滋病期,CD4,病毒载量,抗HIV 的CTL,HIV抗体,.,HIV感染的自然史 CD4细胞 急性感染期,HIV,感染者的三种临床转归,Virus,CD4,CD8,a,HIV,CD4,CD4,CD8,CD8,a,HIV,Virus,Virus,Standard 8 y,Fast:4-5 y:(2%)(CCR genes,HLA B35,Slow:10 y:(2%),CCR genes,HLA B57,.,HIV感染者的三种临床转归VirusCD4CD8 aHIVC,免疫功能与机会性感染相关性,years,200,CD4 counts,白念菌,Zona,卡波济肉瘤,淋巴瘤,PCP,弓型体,CMV,MAIC,4,8,艾滋病期,HIV load,2,10,.,免疫功能与机会性感染相关性 years200CD4 coun,细胞免疫功能的抗感染作用,不重视机体免疫功能的后果,化疗药物的滥用,耐药菌的产生,二重感染的发生,进一步损害免疫功能,.,细胞免疫功能的抗感染作用不重视机体免疫功能的后果化疗药物,细胞免疫功能与感染,细胞免疫功能的抗感染作用,正常人的免疫功能,细胞免疫的抗感染作用,T细胞免疫功能的测定,T细胞亚群,T细胞功能,细胞免疫功能测定的临床意义,.,细胞免疫功能与感染细胞免疫功能的抗感染作用.,细胞免疫功能与感染,免疫功能测定方法,体内,：,PPD试验？,体外,：,体液免疫：,B细胞数量，免疫球蛋白定量,细胞免疫：T细胞亚群的数量和功能,（流式细胞仪，ELISA，ELISPOT）,.,细胞免疫功能与感染免疫功能测定方法体内：.,T细胞免疫功能的测定,T细胞功能,（细胞介素，增殖反应）,功能亚群（CD28）,激活亚群（CD38、HLA-Dr）,纯真亚群和记忆亚群,凋亡亚群,Treg,（T细胞、CD4、CD8、B、NK）,.,T细胞免疫功能的测定T细胞功能功能亚群（CD28）（T细胞、,A cytometer looks like an easy-to-use machine,but look inside:,Its a complex laser machine!,.,A cytometer looks like an easy,PMT,PMT,PMT,PMT,4,Dichroic,Filters,Bandpass,Filters,Flow Cytometry Principle,Laser,1,2,3,4,Flow cell,.,PMTPMTPMTPMTDichroicFiltersBan,T细胞免疫功能的测定,T细胞功能,（细胞介素，增殖反应）,功能亚群（CD28）,激活亚群（CD38、HLA-Dr）,纯真亚群和记忆亚群,凋亡亚群,Treg,（T细胞、CD4、CD8、B、NK）,.,T细胞免疫功能的测定T细胞功能功能亚群（CD28）（T细胞、,淋巴细胞免疫表型检测指标,B淋巴细胞（CD19+）,反映机体体液免疫功能状态,自然杀伤细胞（CD3-CD16/56+）,反映机体天然免疫功能状态,辅助性及杀伤性T淋巴细胞（CD3+CD4+/CD8+）,反映机体细胞免疫功能状态,T淋巴细胞纯真和记忆亚群（CD4+CD45RA+62L+/CD45RO+）,判断CD3+CD4+降低的重要指标,T淋巴细胞的激活亚群（CD4+/CD8+CD38+/HLA-DR+）,评价细胞的激活状态。,T淋巴细胞的功能亚群（CD4+/CD8+CD28+）,衡量T淋巴细胞功能的重要指标。,.,淋巴细胞免疫表型检测指标B淋巴细胞（CD19+）反映机体体,不同年龄组正常细胞亚群的建立,淋巴细胞表型,青年(18-40y,N=57),中年(41-60,N=45),老年(大于61y,N=52),B淋巴细胞,6.430.6,104571,4.219.7,77566,2.424.3,39544,自然杀伤细胞,4.235.6,96872,3.540.4,53985,4.149.8,711340,辅助性T淋巴细胞,25.164.0,4421645,19.854.0,2591946,19.655.2,2911730,杀伤性T淋巴细胞,16.747.2,3211166,15.942.3,208825,8.244.4,1731114,T淋巴细胞纯真亚群,17.461.5,117586,5.268.5,40716,2.262.7,25688,CD4/CD8,0.573.28,0.553.30,0.625.97,.,不同年龄组正常细胞亚群的建立淋巴细胞表型青年(18-40y,细胞免疫功能测定方法,T细胞功能的测定,T细胞增殖功能,同位素H3掺入试验,BrdU，Ki67,CFSU,T细胞毒试验（CTL）和细胞介素测定,同位素Cr51,四联体,ELISA,流式细胞仪,ELISPOT,.,细胞免疫功能测定方法T细胞功能的测定T细胞增殖功能.,ELISPOT 方法,ELISPOT方法是目前国际上广泛应用的较新的体外测定特异性抗体分,泌细胞和细胞因子分泌细胞的方法。该方法可在单细胞水平检测淋,巴细胞对特异性抗原的反应能力及计数特异性抗原刺激下细胞因子,分泌细胞的频数。,优点：,敏感,-能检测产生细胞因子频率极低的细胞，灵敏度高达,1/1000000。,特异,直观,-可直接在显微镜下人工计数斑点或通过ELISPOT分,析系统对斑点进行计数，1 个斑点代表 1 个特异性,抗体分泌细胞或细胞因子分泌细胞。,.,ELISPOT 方法ELISPOT方法是目前国际上广泛应用的,ELISPOT 原理,-PBMC,-刺激原,孵育16 18h或4048h,IFN抗体,B,S,PA,酶和底物,斑点!,.,ELISPOT 原理-PBMC-刺激原孵育16 18,ELISpot 结果,阴性对照,阳性对照,样本孔,样本孔,图中的每个斑点代表一个能分泌IFN-,的抗原特异性CD4+T细胞或CTL,.,ELISpot 结果阴性对照阳性对照样本孔样本孔图中的每个斑,T细胞免疫功能与感染,T细胞免疫功能的抗感染作用,正常人的免疫功能,T细胞免疫的抗感染作用,T细胞免疫功能的测定,T细胞亚群,T细胞功能,T细胞免疫功能测定的临床意义,.,T细胞免疫功能与感染T细胞免疫功能的抗感染作用.,T细胞免疫功能与感染,细胞免疫功能测定的临床意义,HIV感染和艾滋病,其它各种感染性疾病,-病毒感染：SARS,HBV，HCV，EBV，,CMV，HFRS,HFMD,-结核病，真菌感染。,肿瘤和化疗病人的免疫功能监测,器官移植病人的免疫监测,自身免疫病和过敏性疾病,.,T细胞免疫功能与感染细胞免疫功能测定的临床意义HIV感染,细胞免疫功能与感染,细胞免疫功能测定的临床意义,中国HIV/AIDS的免疫病理,改变和免疫重建,.,细胞免疫功能与感染细胞免疫功能测定的临床意义中国HIV/,艾滋病的主要免疫病理改变,CD4+T 细胞数的减少；,CD4+T 功能的减低;,异常的细胞免疫激活。,.,艾滋病的主要免疫病理改变CD4+T 细胞数的减少；.,HIV感染的自然史,CD4细胞,(cell/mm3）,800,400,急性感染期,无症状期,艾滋病前期和艾滋病期,CD4,病毒载量,抗HIV 的CTL,HIV抗体,.,HIV感染的自然史 CD4细胞 急性感染期,HIV/AIDS 患者淋巴细胞亚群与正常对照比较,HIV/AIDS患者,n=263,正常对照,n=57,B细胞计数,109(159,71)*,261(294,207),NK细胞计数,110(195,61)*,339(471,234),CD4+T计数,205(348,63)*,787(1058,615),纯真CD4+T计数,29(86,6)*,328(382,256),纯真CD4+T比例,18.5(32.0,6.5)*,35.4(45.5,30.0),记忆CD4+T计数,136(232,44)*,453(538,360),记忆CD4+T比例,72.6(83.2,60.1)*,56.0(66.3,47.7),CD4+CD28+功能亚群比例,86.1(94.0,68.3)*,95.7(97.6,91.0),CD8+T计数,652(914,422),538(642,480),CD8+CD38+激活亚群比例,84.3(92.7,69.0)*,42.6(50.6,36.1),（计数：个/mm,3,，比例：%，数值以中位数（上四分位数，下四分位数）表示）,*与正常对照组相比存在显著差异,P,0.001。,与正常对照组相比存在显著差异,P,=0.021。,.,HIV/AIDS 患者淋巴细胞亚群与正常对照比较HIV/AI,早中晚3组,患者淋巴细胞亚群的比较,分组,组,n=131,组,n=66,组,n=66,CD4+T细胞计数,63(134,20),279(317,246),493(627,413),病毒载量,4.88(5.41,4.46),4.3(4.71,3.69),3.49(4.22,2.73),B细胞计数,84(118,51)*,130(171,91),161(216,123),纯真CD4+T比例,11.5(25.5,4.7)*,26.3(37.4,15),25.4(40.2,14.1),记忆CD4+T比例,77.8(88.3,66.7)*,67.2(79.1,58