造血干细胞捐献者的HLA基因分型

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,造血干细胞捐献者血样的,HLA,基因定型及资料录入,邓志辉,深圳市输血医学研究所 2005年5月16日,主要工作流程,一、各“工作站将审核、遴选合格的造血干细胞捐献者血样贴有骨髓条码，以及捐献者样本清单捐献者姓名及骨髓编号，一并送达我研究所免疫遗传实验室；,二、免疫遗传实验室对捐献者血样进行HLA-A、B和DRB1基因定型，对送检血样的HLA基因定型结果负责；,三、出具“捐献者HLA基因分型检测结果报告。,主要内容,1捐献者HLA基因定型血样的运输,2HLA相关基本概念,3HLA分型定型技术,HLA血清学分型技术,HLA基因分型技术,捐献者,HLA,基因定型血样的运输,本卷须知：,1、因“登记表中填写的内容审核不合格血样、以及经HBV等化验检查健康不合格的血样，予以剔除；,2、检查血样管有无破管；,3、路途远、条件许可，可放置适量干冰；,4、由专人运送，防震、防颠覆；,5、合格的HLA基因定型血样与捐献者样本清单一并送往组织配型实验室。,人类白细胞抗原(,Human Leucocyte Antigen, HLA),1958年，Dausset采用白细胞凝集实验，检测出第一个人类白细胞 抗原MacA2。,为高度复杂的遗传多态性系统，每个人的HLA千差万别，即人体生物学的“身份证 ，,不同的民族、同一民族不同的地域，HLA基因及单倍型分布有其特点，,HLA为人类主要组织相容性系统MHC，与移植排斥反应密切相关，又称移植抗原。,是机体“识别自身、“排除异已的主要遗传标记，参与免疫应答反应。,HLA基因家族位于人类第6号染色体短臂，全长3.6 Mb，HLA基因家族是迄今为止最复杂、多态性最丰富、免疫功能相关基因最集中、与疾病关联最密切的一个区域。,HLA,抗原的分类,HLA-I,类：由一条具有多态性的,多肽链和一条没有多态性的,2,微球蛋白通过非共价键组成异二聚体。,经典,HLA-I,类抗原：包括,HLA-A、B、C,位点抗原，分布于几乎所有有核细胞表面上。如,T,淋巴细胞、,B,淋巴细胞等，血小板上吸附,HLA-A、B,抗原。,非经典,HLA-I,类抗原：包括,HLA-E、G 、F,位点抗原，抗原在特定时间选择性分布。,HLA-II,类：由34,KD,的,链和29,KD,的,链以非共价键连接而成，包括,HLA-DR、DP、DQ,抗原；,仅分布于,B,淋巴细胞、巨噬细胞、树突细胞等少数细胞表面。,HLA-,类：主要包括补体分子,C2、C4,及,Bf,等。,HLA,抗原结构,HLA,的免疫原性及骨髓库建库工作中常规检测的,HLA,位点,HLA是一个高度复杂的遗传多态性系统，如：,经典HLA-I类抗原：HLA-A、B、C位点抗原；,非经典HLA-I类抗原：HLA-E、G 、F位点抗原,HLA-II类：HLA-DR、DP、DQ位点抗原,HLA的免疫原性，主要以HLA-A、B和DRB1的免疫原性较强，因此，骨髓库建库工作中，通常仅对HLA-A、B和DRB1位点进行定型。,无关供者骨髓移植中，NMDP、JMDP有研究资料说明，供/受者对HLA-CW基因的匹配程度，与GVHD、移植成活率相关。,HLA,基因,定位于人类第6号染色体短臂6p21.31，全长3.6 Mb，占人类基因组碱基数的0.1%。,HLA-I类基因：有10个遗传座位，靠近染色体顶端，HLA-A、B、C、E、G、 F为表达基因，H、J、K、L为假基因，无基因产物。,HLA-类基因：靠近染色体着丝粒端，主要包括HLA-DR、DP、DQ基因座。,HLA,基因结构,体细胞为二倍体，同源染色体之间相互配对，,每一,HLA,位点有,2,个等位基因，一个来自于母亲，另一个来自于父亲。,检测,HLA-A,、,B,和,DRB1,三个位点，有,6,个等位基因，即,6,个,HLA,分型数据。,检出的,HLA,抗原及等位基因,2003年世界卫生组织WHOHLA因子命名委员会命名的HLA等位基因：,HLA座位 等位基因 特异性,HLA-A 250 24,HLA-B 490 49,HLA-Cw 119 13,HLA-DRB1 315 17,HLA-DPB1 99 6,HLA-DQB1 53 7,HLA 系统等位基因丰富，每个人的等位基因型千差万别，可以说在随机人群中，难以有完全相同的。,HLA,的命名,1、血清学命名：遗传位点后用数字表示，如A1、A2、A3、B5等。,以大写字母A、B、C表示HLA的遗传座位；HLA特异性以数字表示；除HLA-A、B位点抗原的特异性的命名数字不重复外，其它位点抗原连续独立命名；C位点抗原以Cw为字首命名，以和补体系统区别。,2、HLA等位基因命名原那么：位点后加“*，再加数字表示。如DRB4*01 03 1 02 N,第1、2位数表示HLA抗原的特异性，第3、4位数表示等位基因亚型，结尾加N表示无效等位基因或不表达基因。,HLA等位基因所对应的血清学特异性，可查阅过WHO公布的HLA字典。,HLA低分辨水平基因定型：确定HLA基因前2位数。,HLA高分辨水平基因定型：确定HLA基因第4位以后的数字。,HLA,的生物学功能,HLA参与免疫应答反应，与抗原肽结合形成HLA-抗原肽复合物，抗原提呈细胞将此复合物交由T淋巴细胞处理，T细胞上的T细胞受体TCR能够对抗原提呈细胞上的HLA-抗原肽复合物产生双识别，从而介导免疫反应。,T,细胞受体对,HLA-,抗原肽复合物的双识别作用,人类白细胞抗原HLA的应用,HLA分型在骨髓和器官移植组织型,法医学亲子鉴定和个体识别,人类种群学,安全输血,疾病相关联的研究等领域如HLA-B27,HLA,分型技术,1、传统的血清学和细胞学分型方法,因需要有活性的细胞、定型血清或分型细胞来源困难、分型准确性较差等原因，已逐步被淘汰。,2、PCR为基础的HLA基因分型技术,分型所需要的血样量少，不需要有活性的细胞，实验重复性好、结果的准确性高，易于质控和准标化。HLA基因分型技术取代了血清学方法。,当前的“中国造血干细胞捐献者资料库的建库技术，不同于以往的“中华骨髓库。前者采用基因定型技术检测HLA-A、B、DRB1基因，后者采用血清学方法检测HLA-A、B抗原。,“中国造血干细胞捐献者资料库对捐献者血样HLA基因分型技术的要求,对HLA-A、B和DRB1进行基因分型，分辨率达低分辨水平。,结果既报告每一样本的基因型，同时报告对应的特异性。,通过各省级组织配型实验室室内质控，以及国家“HLA质控实验室组织的室间质控对HLA基因分型的准确性进行质量监控。,HLA,基因分型技术,PCR-序列特异性引物PCR-SSP,PCR-SSO流式磁珠分析,HLA测序分型SBT,PCR-序列特异性寡核苷酸探针PCR-SSOP,基因芯片技术,参比链介导的构象分析(RSCA),HLA单倍体基因测序,HLA,基因分型的步骤,1、DNA提取,2、PCR扩增,3、PCR扩增产物的检测,4、结果分析判别受检者HLA基因型,5、HLA基因定型报告,PCR-序列特异性引物PCR-SSP分型技术,基本原理：,使用序列特异性引物SSP,特异性扩增HLA等位基因，电泳,分离PCR扩增产物，根据是否存,在PCR产物以及片段大小，确定,相应基因。,主要步骤：,1、DNA提取,2、PCR扩增,3、琼脂糖凝胶电泳检测,4、结果分析,PCR-序列特异性引物PCR-SSP分型技术,PCR-序列特异性引物PCR-SSP分型技术,特点：简便、快速、直观等，特别适合于尸肾移植的组织配型；所需设备简单，易于开展；为常规采用的经典,HLA,基因分型技术。,应用：适合于经典,HLA-,、,类分子的基因分型,分辨率：低分辩、高分辩基因分型水平。,PCR-SSO,流式磁珠分析技术,基本原理：,以反向核酸杂交为基础，杂交产物采用流式磁珠仪进行自动检测，为高通量,HLA,基因定型技术。,PCR-SSO流式磁珠分析技术的特点一,实验原理、引物设计、扩增产物的检测等，与SSP分型技术不同。,PCR扩增反应结束后，将标记探针的磁珠直接加入PCR产物中，微量离心管反应板置于PCR扩增仪上进行分子杂交；,杂交产物用流式磁珠仪进行自动进样检测，用HLA分析软件确定HLA基因型。,流式磁珠分析技术的特点二,配合,DNA,全自动,DNA,提取仪及多个,PCR,基因扩增仪，具有高通量、操作简便、快速特点。适合骨髓库、脐血库大批量样本的,HLA,基因分型工作。,基于流式磁珠分析技术，已有多家商品化、低分辩水平的,HLA,基因分型试剂盒。,可用于,HLA-A、B、C、DRB1,和,DQB1,座位的基因分型。,HLA测序分型SBT技术,HLA-,座位,检测对象,HLA-A,第2，3，4 外显子的正、反向序列,HLA-B,第2，3，4 外显子的正、反向序列,HLA-Cw,第2，3外显子正、反向序列,HLA-DRB1,第2外显子正、反向序列，,Condon 86,反向序列。,HLA-DQB1,第2外显子正、反向序列，第3外显子的反向测序。若存在,DQB1*0201/0202,或,0301/0309，,分析第3外显子的测序结果,。,HLA测序分型SBT技术,国际公认的,HLA,基因分型方法，高分辨率、高精度；,HLA,测序分型技术较复杂，受实验室设备条件、试剂价格的限制，以往能够开展,HLA,测序分型的实验室尚不多；,随着非血缘关系造血干细胞移植供/受者对,HLA,高分辩确认实验，以及人类学研究、,HLA,与疾病相关联等领域的需要，,SBT,技术的开展已日益增多。,HLA测序分型SBT技术,可在同一,PCR,反应条件,、同一测序反应的条件下，,对不同,HLA,座位进行同步,扩增，简化了实验操作；,随着毛细管电泳基因测,序仪及新的,HLA,分析软件,的应用，,HLA,测序分型处,理样本的能力逐步高通量,化。,HLA,基因分型技术的展望,HLA,基因分型技术呈现多元化趋势，,HLA,基因分型涵盖面不断扩大；,低分辩、中分辩向高分辩水平发展；,分型结果的准确性和精确度不断提高；,实验操作更为简便快速；,不同的,HLA,分型技术，其实验原理、优缺点不同，因而各实验室可根据自身的目的、需要并结合自身的技术工作平台，加以选择应用。,谢谢！,