蛋白质的理化性质和分离纯化

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,一、蛋白质的两性电离,蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液,pH,条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。,*,蛋白质的等电点,( isoelectric point, pI),当蛋白质溶液处于某一,pH,时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的,pH,称为,蛋白质的等电点。,蛋白质的理化性质和分离纯化,（二）蛋白质的胶体性质,蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自,1,万至,100,万之巨，其分子的直径可达,1,100nm,，为胶粒范围之内。,*,蛋白质胶体稳定的因素,颗粒表面电荷,水化膜,+,+,+,+,+,+,+,带正电荷的蛋白质,带负电荷的蛋白质,在等电点的蛋白质,水化膜,+,+,+,+,+,+,+,+,带正电荷的蛋白质,带负电荷的蛋白质,不稳定的蛋白质颗粒,酸,碱,酸,碱,酸,碱,脱水作用,脱水作用,脱水作用,溶液中蛋白质的聚沉,（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固,*,蛋白质的变性,(denaturation),在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。,造成变性的因素,如,加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等,。,变性的本质,破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。,应用举例,临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。,此外,防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。,若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为,复性,(renaturation),。,天然状态，有催化活性,尿素、,-,巯基乙醇,去除尿素、,-,巯基乙醇,非折叠状态，无活性,*,蛋白质沉淀,在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。,变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。,*,蛋白质的凝固作用,(protein coagulation),蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。,（四）蛋白质的紫外吸收,由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在,280nm,波长处有特征性吸收峰。蛋白质的,OD,280,与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。,（五）蛋白质的呈色反应,茚三酮反应,(ninhydrin reaction),蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。,双缩脲反应,(biuret reaction),蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为,双缩脲反应,，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。,二、蛋白质的分离和纯化,（一）透析及超滤法,*,透析,(dialysis),利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。,*,超滤法,应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。,（二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀,*,使用,丙酮沉淀,时，必须在,0,4,低温下进行，丙酮用量一般,10,倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。,*,盐析,(salt precipitation),是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。,（三）电泳,蛋白质在高于或低于其,pI,的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术,称为,电泳,(elctrophoresis),。,根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。,几种重要的蛋白质电泳,*,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳,，常用于蛋白质分子量的测定。,*等电聚焦电泳,，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。,*双向凝胶电泳,是蛋白质组学研究的重要技术。,（四）层析,层析,(chromatography),分离蛋白质的原理,待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 。,蛋白质分离常用的层析方法,* 离子交换层析：,利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。,* 凝胶过滤,(gel filtration),又称分子筛层析，,利用,各,蛋白质分子大小不同分离。,问答题和计算题,1,、为什麽说蛋白质是生命活动最重要的物质基础？,2,、试比较,Gly,、,Pro,与其它常见氨基酸结构的异同，它们对多肽链二级结构的形成有何影响？,3,、试举例说明蛋白质结构与功能的关系（包括一级结构、高级结构与功能的关系）。,4,、为什么说蛋白质水溶液是一种稳定的亲水胶体？,5,、什麽是蛋白质的变性？变性的机制是什麽？举例说明蛋白质变性在实践中的应用。,6,、已知某蛋白质的多肽链是,-,螺旋。该蛋白质的分子量为,240 000,，求蛋白质的分子长度。,(,蛋白质中一个氨基酸的平均分子量为,120),名词解释,等电点（,pI,） 肽键和肽链 肽平面及二面角 一级结构 二级结构 三级结构 四级结构 超二级结构 结构域 蛋白质变性与复性 分子病 肽,三、是非题,1.,构成蛋白质的,20,种基本氨基酸除脯氨酸外，在结构上的共同点是与羧基相邻,-,碳原子上都有一个氨基。,( ),2.,一个氨基酸在水溶液中或固体状态时是以两性离子形式存在。,( ),3. .,构型的改变必须有旧共价键的破坏和新共价键的形成，而构象的改变则不发生此变化。,( ),4.,肽的命名是从肽链的游离氨基开始的。,( ),5.,蛋白质分子中肽链能自由旋转。,( ),6.,所有的蛋白质都具有一、二、三、四级结构。,.( ),7.,蛋白质在,pl,时其溶解度最小。,( ),时，所有氨基酸都带正电荷。,.( ),9.SDSPAGE,中,肽链越长，结合的,SDS,分子越多，故泳动速度越快。,( ),10.,该氨基酸溶液的,pH,大于它的,pI,时,则该氨基酸在电场中向正极移动。,( ),11.,蛋白质分子的四级结构是指多个肽键通过共价键连成的整体分子。,( ),12.,血红蛋白与肌红蛋白均为氧的载体，前者是一个典型的变构蛋白，后者则不是。,.( ),13.,变性的蛋白质的分子量发生了变化。,( ),14.,蛋白质的亚基（或称亚单位）和肽键是同义的。,( ),15.SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳法测蛋白质分子量是依据不同蛋白质所带电菏的不同而分离的。,( ),16.,蛋白质变性作用的实质就是蛋白质分子中所有的键均被破坏引起天然构象的解体。,( ),17.,变性蛋白质溶解度降低是因为蛋白质分子的电荷被中和以及除去了蛋白质外面的水化层所引起的。,( ),18.,天然氨基酸都具有一个不对称,a-,碳原子。,( ),19. .,蛋白质分子中所有氨基酸（除甘氨酸外）都是左旋的。,( ),20. .,只有在很高或很低,pH,值时，氨基酸才主要以非离子化形式存在。,( ),四、填空,1.,氨酸的结构通式为,。,2.,在,pH7.0,的缓冲液中，向阴极移动的氨基酸是,_,、,_,和,_,。,3.,肽链中,共有,_,个原子同在一个肽平面上。,4.-,折叠结构的氢键是由邻近两条肽链中一条的,_,基因与另一条的,_,基之间所形成。,5.,维持蛋白质一级结构的化学键有,_,和,_,；维持蛋白质二级结构的力是,_,；,a,螺旋是链,_,氢键，而维持三、四级结构靠,_,、,_,、,_,、,_,和,_,。,6.,分离纯化蛋白质常用的盐析剂是,_,。,7.,电泳是在一定的,_,下，根据各种蛋白质分子本身的,_,和,_,不同，因而在电场中移动的,_,不同而进行分离的方法。,8.,天然蛋白分子中,-,螺旋大多属于,_,手螺旋。,9.,蛋白质在等电点时溶解度最,_,，粘度最,_,，导电性最,_,。,10.,用分光光度法测定蛋白质在,280nm,有吸收，这是因为蛋白质分子中的,_,、,_,和,_,三种氨基酸残基侧链基团起作用。,11.,组成蛋白质分子的碱性氨基酸有,、,和,。酸性氨基酸有,和,。,12.,维持蛋白质构象的化学键有,、,、,、,、,和,。,13.,血红蛋白（,Hb,）与氧结合的过程呈现,效应，是通过,Hb,的,现象实现的。,14.,当溶液中盐离子强度低时，可增加蛋白质的溶解度，这种现象称,。当溶液中盐离子强度高时，可使蛋白质沉淀，这种现象称,。,五,.,单项选择,1.,下列氨基酸中，哪个含有吲哚环？（）,（,A,）甲硫氨酸（,B,）苏氨酸（,C,）色氨酸（,D,）缬氨酸（,E,）组氨酸,2.,下列有关氨基酸的叙述，哪个是错误的？（）,（,A,）酪氨酸和苯丙氨本都含有苯环,（,B,）酪氨酸和丝氨酸都含羟基,（,C,）亮氨酸和缬氨酸都是非极性氨基酸,（,E,）组氨酸、色氨酸和脯氨酸都是杂环氨基酸,3.,下列氨酸溶液除哪个外都能使偏振光发生旋转？（）,（,A,）丙氨酸（,B,）甘氨酸（,C,）亮氨酸（,D,）丝氨酸（,E,）缬氨酸,4.,测得某一蛋白质样品的氮含量为,0.40,克，此样品约含蛋白质多少克？,( ),(A) 2.00g,，,(B) 2.50g,，,(C) 3.00g,，,(D) 6.25g,5.,下列含有两个羧基的氨基酸是：,( ),(A),精氨酸,(B),赖氨酸,(C),色氨酸,(D),谷氨酸,6.,含有疏水侧链的一组氨基酸是：,( ),(A),色氨酸、精氨酸，,(B),苯丙氨酸、异亮氨酸，,(C),精氨酸、亮氨酸，,(D),蛋氨酸、组氨酸,7.,肽键在下列哪个波长具有最大光吸收？（）,(A,）,215nm,（,B,）,260nm,（,C,）,280nm,（,D,）,340nm,（,E,）以上都不是,8.,有一多及经酸水解后产生等摩尔的,Lys,、,Gly,和,Ala,。如用胰蛋白酶水解该肽，仅发现有游离的,Gly,和一种二肽。下列多肽的一级结构中，哪一个符合该肽的结构？（）,(A)Gly,Lys,Ala,Gly,Ala,（,B,）,Ala,Lys,Gly,(C)Lys,Gly,Ala,(D) Gly,Lys,Ala,(E) Ala,Gly,Lys,9. .,关于肽键特点叙述错误的是：,( ),(A),肽键的,C-N,键具有部分双键性质，,(B),与,alpha-,碳原子相连的,N,和,C,所形成的化学键可以自由旋转，,(C),肽键可以自由旋转，,(D),肽键中,C-N,键所相连的四个原子基本处于同一个平面上,10.,蛋白质所形成的胶体颗粒，在下列那种条件下不稳定：,( ),(A),溶液,pH,值大于,pI,，,(B),溶液,pH,值等于,pI,，,(C),溶液,pH,值小于,pI,，,(D),在水溶液中,11.,蛋白质的等电点是：,( ),(A),蛋白质的溶液的,pH,值等于,7,时溶液的,pH,值，,(B),蛋白质分子呈正离子状态时溶液的,pH,值，,(C),蛋白质分子呈负离子状态时溶液的,pH,值，,(D),蛋白质的正电荷与负电荷相等时溶液的,pH,值,12.,蛋白质变性是由于：,( ),(A),氨基酸排列顺序的改变，,(B),肽键的断裂，,(C),蛋白质空间构象的破坏，,(D),蛋白质的水解,13.,变性蛋白质的主要特点是：,( ),(A),黏度下降，,(B),溶解度增加，,(C),生物学活性丧失，,(D),容易被盐析出现沉淀,14.,下列那种因素不能使蛋白质变性：,( ),(A),加热震荡，,(B),强酸强碱、有机溶剂，,(C),重金属盐，,(D),盐析,15.,蛋白质变性不包括：,( ),(A),氢键断裂，,(B),肽键断裂，,(C),疏水键断裂，,(D),二硫键断裂,16.,若用重金属沉淀,pI=8,的蛋白质时，该溶液的,pH,值应为：,( ),(A) 8,，,(B) 8,，,(C) =8,17.,蛋白质一级结构与功能关系的特点是（）,（,A,）相同氨基酸组成的蛋白质，功能一定相同,（,B,）一级结构相近的蛋白质，其功能类似性越大,（,C,）不同结构中任何氨基酸的改变，其生物活性即消失,（,D,）不同生物来源的同种蛋白质，其一级结构相同,（,E,）以上都不对,18.,通过凯氏微量定氮测得某样品的总蛋白氮为,2.0,克,该样品含多少克蛋白质？,( ),（,A,）,28.14,（,B,）,18.56,（,C,）,14.07,（,D,）,12.5,19,某一溶液中蛋白质的百分含量为,45,，此溶液的蛋白质氮的百分浓度为：,A,8.3% B,9.8% C,6.7% D,5.4% E,7.2,20,下列含有两个羧基的氨基酸是：,A,组氨酸,B,赖氨酸,C,甘氨酸,D,天冬氨酸,E,色氨酸,21,下列哪一种氨基酸是亚氨基酸：,A,脯氨酸,B,焦谷氨酸,C,亮氨酸,D,丝氨酸,E,酪氨酸,22,维持蛋白质一级结构的主要化学键是：,A,离子键,B,疏水键,C,肽键,D,氢键,E,二硫键,23,关于肽键特点的错误叙述是：,A,肽键中的,C-N,键较,C-N,单键短,B,肽键中的,C-N,键有部分双键性质,C,肽键的羰基氧和亚氨氢为反式构型,D,与,C-N,相连的六个原子处于同一平面上,E,肽键的旋转性，使蛋白质形成各种立体构象,24,关于蛋白质分子三级结构的描述，其中错误的是：,A,天然蛋白质分子均有这种结构,B,有三级结构的多肽链都具有生物学活性,C,三级结构的稳定性主要是次级键维系,D,亲水基团聚集在三级结构的表面,E,决定盘曲折叠的因素是氨基酸残基,25,具有四级结构的蛋白质特征是：,A,依赖肽键维系四级结构的稳定性,B,在三级结构的基础上，由二硫键将各多肽链进一步折叠、盘曲形成,C,每条多肽链都具有独立的生物学活性,D,分子中必定含有辅基,E,由两条或两条以上具有三级结构的多肽链组成,26,含有,Ala,，,Asp,，,Lys,，,Cys,的混合液，其,pI,依次分别为,6.0,，,2.77,，,9.74,，,5.07,，在,pH9,环境中电泳分离这四种氨基酸，自正极开始，电泳区带的顺序是：,A,Ala,，,Cys,，,Lys,，,Asp B,Asp,，,Cys,，,Ala,，,Lys,C,Lys,，,Ala,，,Cys,，,Asp,D,Cys,，,Lys,，,Ala,，,Asp E,Asp,，,Ala,，,Lys,，,Cys,27,变性蛋白质的主要特点是：,A,粘度下降,B,溶解度增加,C,不易被蛋白酶水解,D,生物学活性丧失,E,容易被盐析出现沉淀,28,蛋白质分子在,280nm,处的吸收峰主要是由哪种氨基酸引起的,A,谷氨酸,B,色氨酸,C,苯丙氨酸,D,组氨酸,E,赖氨酸,