血液MICM诊断

血液的,MICM,综合诊断,背景介绍,血液病,是原发于造血系统的疾病，或影响造血系统伴发血液异常改变，以贫血、出血、发热为特征的疾病。,出血性疾病,贫血症,白细胞疾病,常见血液病,造血系统恶性肿瘤,白血病的诊断分型,MICM,FAB,形态学诊断,(,M,orphology),免疫学检查,(,I,mmunology ),细胞遗传学检查,(,C,ytogenetics,),分子遗传学检查,(,M,olecular),检测方法,病史,形态学：,结构：活检,细胞学：涂片,骨髓血凝块,免疫分型：,流式细胞或免疫组化,细胞遗传学：核型分析、,FISH,分子遗传学：融合基因（,RT-PCRQ-PCR)/,基因突变（测序）,白血病,MICM,诊断程序及技术,白血病诊断的任务,不仅仅是,FAB,分类,是不是白血病？,急性？慢性？,系来源,FAB,分类,预后分层,治疗、疗效判断,MRD,病史,+,形态,形态,+,免疫,形态,+,免疫,+,遗传,+,分子,形态,+,免疫,+,遗传,+,分子,为什么需要,MICM,综合诊断？,形态或病理或加细胞化学分析受观察者个体经验及分辨力的限制，一致率仅,50-70%,；,在此基础上增加免疫组化和,/,或,FCM,分析大大增加了分型的准确率，可达,90%,以上；,染色体、,FISH,及基因分析，进一步提高分型的准确率,MICM,整合诊断的临床意义,全面正确诊断与分型,评估预后,确立检测,MRD,的标志，追踪,MRD,帮助建立分层、个性化的治疗,定期追踪帮助发现抗原丢失、克隆演变或突变,帮助确定病因或发病机制,MICM,整合报告,形态学,是诊断的基础，任何淋巴造血系统增生性疾病的诊断都离不开形态学诊断。形态学诊断技术包括,细胞学：外周血、骨髓涂片，淋巴组织穿刺,组织学：骨髓活检、淋巴组织活检,骨髓活检和骨髓,/,血涂片,骨髓涂片细胞细微结构清楚评估红系、粒系增生情况及幼稚细胞比例具有优势,骨髓纤维化、细胞致密可干抽,可做组织化学染色（如铁染）,对缺铁性贫血、慢性疾病引起的贫血、巨幼细胞性贫血、和急性白血病的诊断尤其有帮助。,骨髓活检显示骨髓的组织结构和各成分的分布及相互关系，对巨核细胞的评估具有优势,不存在干抽和骨髓稀释,可做免疫组织化学染色,对再生障碍性贫血、低增生性白血病、淋巴瘤、转移癌、骨髓增生性肿瘤的诊断具有重要价值,血凝块：废物利用、骨髓活检的补充,注明病史,骨髓涂片看细胞、骨髓活检看结构，,相互补充相互验证,不能相互替代,骨髓,/,血涂片,骨髓活检,1.,骨髓活检,+3,项特染,2.,骨髓涂片,+,组织化学染色（,3,）,3.,免疫组织化学染色,4-10,项,4.,血块,骨髓活检可根据个性化病理诊断需要加做免疫组织化学染色！,免疫组化,长度 达标（,1cm,尚可）,长度 ,1cm,不达标,长度 可能存在诊断不全面,（不包括皮肤、肌肉、软骨、血块等）,附,2,张合格的骨髓涂片（晾干后再包装）,血块分开固定（收费按小标本病理收费）,注意：取材部位是否有病灶,保存液使用福尔马林固定,骨髓活检标本长度要求,取材的限制,骨髓增生不均匀,(,与血象不符,),取材过少,取材表浅,组织挤压,活检增生低下,涂片增生活跃,骨髓增生不均匀,取材较少,表浅,活检增生活跃,涂片增生低下,骨髓增生不均匀,涂片稀释,骨髓活检与骨髓涂片细胞增生不一致,流式细胞术,流式细胞免疫分型的作用,确定系来源,原理：不同系有特定的抗原表达,髓系,/B,系,/T/NK,系,/,组织细胞和树突状细胞,确定细胞分化阶段,不同发育阶段细胞，其抗原表达不同,预后判断,有些抗原表达和淋巴瘤,/,白血病预后相关,治疗方法选择,-,治疗靶向,疗效判断、复发监测,M0 CD34,CD33,CD13,M1 MPO,CD34,CD33,CD13, HLA-DR,M2 MPO,CD34,CD15,CD13, HLA-DR,M3 MPO, CD33,CD13,、,CD9(HLA-DR,、,CD11b,常阴性,),M4 MPO,CD33,CD15,CD14,CD13,M5 CD68,CD33,CD14,CD13,HLA-DR,CD36,，,CD64,M6 CD33,CD235a,CD71,M7 CD33,CD41,CD42b,CD61,急性髓系白血病免疫表型与,FAB,分型相关性,形态与免疫表型的符合性不足,80%,，不能脱离形态学单纯依赖免疫表型进行白血病的诊断与分型。,FAB,基于形态，两者不符以形态为主。,MRD,流式细胞检测,肿瘤细胞与正常起源细胞免疫表型不同,跨系表达,抗原表达不同步,抗原表达丢失,抗原表达减弱,其它抗原表达,初始免疫分型结果、白血病相关表型特点,抗体组合越多覆盖率越高、敏感性越高,假阳性、假阴性均存在,随访、动态观察更有意义,流式检测标本要求,抗凝骨髓,/,外周血,附,2,张合格的骨髓涂片（晾干再包装）,完整的病史,MRD,需要初次分型资料,组套,12,、,18,、,24,、,30,、,36,遗传学诊断技术,细胞遗传学：,核型分析：全基因检测、覆盖面广、敏感性差,FISH,：针对性强、敏感性高、周期短、覆盖率低,分子遗传学：,融合基因（,RT-PCRQ-PCR),：针对性强、敏感性高,基因突变（测序、,PCR,）：覆盖面较大、敏感性较低,染色体异常,包括染色体的,结构,和,数量,异常,根据这些特征性的异常，对恶性血液病进行,诊断和分类,细胞遗传学,G,带,R,带,C,带,急性白血病,染色体检测的临床意义,染色体畸变可以作为急性白血病缓解和复发重要参考，最初治疗后异常核型可以消失提示,CR,，之后重新出现提示白血病复发，有新的核型出现，表明有进展,可以作为标志来验证骨髓移植成功与否,最初诊断的核型是急性白血病预后最有价值指标,预后等级,核型类型,AML,ALL,好,t(8;21),、,t(15;17),、,inv(16),t(12;21),、染色体数目,50,条的超二倍体、,dic(9;12)(p11;p12),中,正常、,+8,、,+21,、,+22,、,11q23,异常、,del(9q),、,del(7q),正常、,47-50,的超二倍体、,t(11;14),差,-5,、,del(5q),、,-7,、,3q,异常、,复杂异常,亚二倍体、近单倍体、,t(9;22),、,t(4;11),、,t(1;19),、,t(8;14),急性白血病核型的预后分级,染色体检测常见问题,标本取材量不足：检测最低白细胞数为,10,的,6,次方个细胞,培养后无分裂相或分裂相少于,15,个：标本白细胞量低，患者正在进行化疗,结果临床不符：分子检测阳性而染色体阴性（染色体分辨率低）,融合基因,BCR/ABL(P210)-,CML/ALL,BCR/ABL(P230)-,CML,BCR/ABL,(P190)-,ALL,PML/RARa-,M3,AML/ETO-,M2,CBF/MYH11X,-,M4EO,MLL,重排,-,M5,FLP1L1-PDGFR,-,嗜酸细胞增多症,基因突变,JAK-2 V617F /539-543,突变,MPL,外显子,10,突变,分子遗传学,-,血液病类型确诊的分子标志,融合基因筛查,适用患者,本筛查项目主要用于筛查,ALL,、,AML,、,CML,、,AMMOL,、,CMML,、,MDS,等血液病病种可能出现的,31,种融合基因或癌基因，及其融合基因的,110,余种剪切变异情况。适合无法确定融合基因类别的,初诊患者,，便于医生对血液病患者进行,分子标志物的确定,，并进行后续,微小残留病灶的监控,。,本项目建议,配合染色体核型分析一起检测,，以免由于染色体数目异常或携带少见融合基因而造成漏诊。,苏州大学附属第一医院对于初诊,ALL,AML,患者都建议做此项目,不同疾病筛查项目,ALL,融合基因筛查（,18,种）,AML,融合基因筛查（,23,种）,APL,融合基因筛查,继,t(15;17),之后，又先后发现,4,种,M3,特异的累及,RAR,的变异性染色体易位：分别产生,PLZF-,RAR,，,NPM-,RAR,，,NuMA-RAR,和,STAT5b-RAR,融合基因。,临床上，具有,PLZF-,RAR,或,STAT5b-RAR,融合基因患者对,ATRA,治疗不敏感，其余三种染色体易位患者经,ATRA,治疗可获完全缓解。,MLL,融合基因筛查,JAK2,基因突变,已列入,WHO2008 MPNs,的诊断标准,V617F,见于,90%,以上的,PV,，约,50%,的,ET,、,PMF,在,PV,中，少部分患者为,JAK2 Exon12,或其它突变,建议,JAK2,基因突变筛查检测以下几种,V617F; K539L; N542-E543del; E543-D544del,MPL,基因突变检测,MPL,和,MPN,MPN,中以,JAK2 V617F,最为常见，,PV,、,ET,、,PMF,中的突变频率分别为,96%,、,55%,、,65%,。,MPL,突变主要见于,ET,和,PMF,，频率分别为,2-5%,和,5-10%,。,MPL,可用于,JAK V617F,阴性的,ET,和,PMF,患者的诊断。,检测目的,用于JAK2 V617F阴性的ET和PMF患者的诊断。,临床考虑ET或PMF的患者可以组合检测,融合基因,BCR-ABL P210,JAK2 V617F,基因突变,MPL,基因突变,基因,阳性率,临床意义,预后,与其他遗传异常相关性,KIT,5%,预后因素,差,t(8;21),inv(16)/t(16;16),FLT3,20-40%,预后因素,差,-,NPM1,30%,（核型正常）,对疾病进行临时性的定义,良好 （如果没有,FLT3,突变）,M4,M5,CD34,-,CEBPA,10%,对疾病进行临时性的定义,良好,M1,，,M2,CD7+,WHO,2008,新界定的突变,AML预后基因突变6项,CEBPA基因TAD1区突变检测,CEBPA基因TAD2区突变检测,CEBPA基因bZIP区突变检测,C-kit17,号外显子,FLT3-ITD,基因突变检测,NPM1,基因突变检测,报告时间：12个工作日,价格：1800元,AML预后基因突变9项,CEBPA基因TAD1区突变检测,CEBPA基因TAD2区突变检测,CEBPA基因bZIP区突变检测,C-kit,（,8,号外显子和,17,号外显子）,FLT3-ITD,基因突变检测,FLT3,基因592位点突变检测,FLT3,基因835位点突变检测,NPM1,基因突变检测,报告时间：12个工作日,价格：2700元,TCR,和,IgH,重排项目,有,5-10%,的患者无法通过常规方法辨别其淋巴系统的增生是恶性增生还是反应性增生。,正常淋巴细胞在成熟过程中重排是多克隆性的，但,恶性肿瘤（,98%,）表现为单克隆性,Ig,和,/,或,TCR,基因重排,。,适用患者及适应症：疑似淋巴瘤患者的,良恶性鉴别诊断,。淋系白血病患者的,鉴别诊断及微小残留跟踪检测,。,目标科室：血液科、,肿瘤科、病理科,现有检测方法及相关技术,PCR,结合毛细管电泳技术（,Genescan,）：,分辨率高，不易产生假阳性或假阴性,PCR,结合聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,ABL,激酶区突变,伊马替尼的长期服用导致部分患者，特别是,CML,急变期（,AP-CML,）的患者，发生伊马替尼的耐药，其耐药发生率在,20-30%,。耐药主要由,ABL,激酶区突变引起，可导致药物疗效下降或失效。,适用患者：伊马替尼，尼洛替尼及达沙替尼治疗,BCR-ABL,阳性,CML,、,ALL,患者,，建议定期检测，尽早发现耐药。,检测范围：,BCR-ABL,融合基因,ABL,激酶区,52,个位点,ABL,激酶区突变与,TKI,耐药的关系,Sara Redaelli, et. al, JCO, 2009,VOL27(3)469-471,分子检测常见问题,标本取材量不足：检测最低白细胞数为,10,的,6,次方个细胞,检测内参偏低：目前原因未知,结果临床不符：分子检测覆盖范围问题，其他情况一般假阴性较少,MICM,整合报告,染色体检查的分析前影响因素,标本要求：,肝素抗凝骨髓,，最少标本量为,2ml,。需要用公司统一配送的,专用肝素钠抗凝管,。,抗凝剂量太多影响培养效果,标本需要,当天送检,，,24,小时,内到达实验室。标本存放于,18-25,常温即可，温度不可高于,25,，不要低于,16,。,温度过高或过低都会影响细胞存活,药物影响及病情影响：,恶性血液病细胞，特别是用药后的细胞存活能力较正常细胞差，不易培养,活细胞进行培养,流式检查的分析前影响因素,标本要求：,EDTA,抗凝骨髓,，最少标本量为,2ml,。,标本需要,当天送检,，,48,小时,内到达实验室。标本存放于,18-25,常温即可，温度不可高于,25,，不要低于,16,。,温度过高或过低都会导致细胞表面抗原脱落，影响结果,药物影响及病情影响：,抗原表达谱改变,流式细胞检测注意事项：,标本要求：,EDTA,抗凝骨髓,/,外周血,2 ml,，避免溶血和凝血，,18-25,常温保存,尽快送检，,切忌冷冻；,药物影响及病情影响：,抗原表达谱改变。,分子生物学检测分析前影响因素,标本要求：,EDTA,抗凝骨髓，,每个检测项目,最少标本量为,2 ml,，同时检测,多个项目,需要,5-6 ml,。,取骨髓前，吸取,少量低浓度肝素,，将针头和注射器壁润湿，然后将,多余肝素打出针管,，再抽取骨髓。肝素过多会,影响,PCR,检测,。,能不用肝素尽量不用，要用也尽可能少用。,标本需要,当天送检,，,48,小时,内到达实验室。,48,小时,内到达实验室。标本存放于,18-25,常温即可，温度不可高于,25,，不要低于,16,。,温度过高或过低都会造成溶血，影响遗传物质的含量,血液病质量体系建设,与,UCLA,（加利福利亚大学）签订病理合作协议，建立了远程病理会诊平台，对疑难病例进行会诊研讨和科研,.,实验室建设,海外专家,艾迪康血液实验室拥有,UCLA,美国多位专科病理医生为顾问同时,与,UCLA,建立远程病理会诊平台，进行疑难病理会诊。,吴亿慧 医学博士,美国病理医生,刘正智 医学博士、理学博士,伊利诺伊大学厄巴纳,-,尚佩恩分校医学院临床副教授，主任病理医师,查宏斌 医学博士,南加利福尼亚永久医疗集团洛杉矶医疗中心血液病理专科执业医师,THANKS!,