放射免疫标记

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,放射免疫技术,放射免疫技术（radioimmunoassay,RIA）是以放射性核素为示踪物的标记免疫分析技术。,常用于定量测定受检样本中的微量物质，在内分泌学、免疫学、药物学、微生物学、生物化学等多个领域得到广泛应用。,但是放射免疫技术总是伴有不同程度放射性污染，目前有逐渐被其他免疫学标记技术所取代的趋势。,放射免疫技术类型主要包括:,放射免疫分析,(radioimmunoassay, RIA),免疫放射分析或免疫放射度量分析(immunoradiometric assay，IRMA),放射免疫分析(RIA),是以放射性核素标记抗原和待测抗原竞争结合一定量的特异性抗体，来测定待测抗原含量的一种竞争免疫学方法。即经典的RIA法。,是目前应用最广的放射免疫技术。,免疫放射分析(IRMA),又称免疫放射度量分析，是以放射性核素标记的抗体与待测抗原发生非竞争性结合反应，来测定待测抗原含量的一种非竞争免疫学方法。,一、放射性核素标记物的制备,放射性核素标记物是指放射性核素标记在目的抗原或抗体上所形成的放射性标记抗原或抗体，是放射免疫技术试剂盒主要组成成份。,（一）放射性核素,放射性核素是指原子核能自发地产生成分或能级的变化，然后变成另一种核素，变化时伴有射线的发射。,其放射量单位有:,放射性活度,放射性比活度,放射性浓度,放射性活度单位时间内的核衰变数，即每秒衰变次数，用贝可勒尔(Becquerel，Bq)表示,1Ci=3.710,10,Bq,放射性比活度是指单位质量样品中所含放射性活度，以Bq/g或Bq/mmol表示,放射性浓度是指单位体积溶液中所含放射性活度，以Bq/ml表示。,放射性核素类别,依衰变方式分、三种，用于放射性标记的有和两类;分别用液体闪烁计数器及计数器测定。,目前常用的是型放射性核素，如,125,I、,131,I、,51,Cr和,60,Co，以,125,I最常用；型放射性核素有,3,H、,14,C和,32,P，以,3,H最常用。,现以,125,I和,3,H为例比较两者的特点(表19-1)。,表19-1,125,I和,3,H标记物特点比较,125,I标记物,3,H标记物,标记方法,方法简便，易获得高比放射性标记物,方法较难，不易获得高比放射性标记物,对标记化合物影响,标记时以I代替H1改变物质结构，可影响抗原免疫学活性,不改变抗原结构，一般不影响抗原免疫活性,测量方法,方法简便、效率高,方法复杂，效率低,测量仪器,计数器,液体闪烁计数器,半衰期,60.2天,约11年,废弃物,处理容易,较难,放射性核素选择原则,高比活度、适宜半衰期、对抗原或抗体没损害并且容易标记。,125,I最接近理想条件，其比活度为6.43810,14,Bq/g，而,14,C的最大比活度为16.6510,10,Bq/g，如果标记量相同，,125,I敏感度比,14,C大3900倍。,(二) 抗原或抗体,用于放射性标记的抗原或抗体的质量直接影响分析的灵敏度和特异性; 用于标记的抗原要求纯度高，并具有足够或完整的免疫活性；,用于标记的抗体应具有高亲和常数、交叉反应率低、抗体滴度高。,（三）放射性核素标记物的制备,RIA和IRMA 分别以放射性核素标记抗原和放射性核素标记抗体检测抗原。,以放射性核素,125,I标记抗原为例说明标记物制备。,1直接标记法,是将,125,I直接结合在蛋白质侧链的酪氨酸残基苯环上，形成单碘酪氨酸或双碘酪氨酸。操作简便，结合效率高，但只能标记含酪氨酸的化合物，有时可能会损害蛋白质的活性。,亦称联结标记法。这种方法是先将放射性碘连接到一个小分子载体上，再将这个小分子载体与蛋白质结合。,具有代表性的方法是Bolton-Hunter法，使用的载体分子是N-琥珀酰亚胺3-(4-羟基苯)-丙酸(SHPP)。标记方法分两步进行，第一步是先用氯胺T法使SHPP碘化，第二步再将碘化SHPP分子偶联到蛋白质分子上。,(四) 放射性标记物的纯化与鉴定,1.放射性标记物纯化 可用葡聚糖凝胶过滤法或薄层层析法、纸层析法、电泳法、高效液相层析法等。,2.放射性标记物的鉴定 理想的放射性标记物是高放射化学纯度、适当的比放射性和免疫活性。,(1) 放射化学纯度,是指结合于抗原上的放射强度占总放射强度的百分率;即碘化蛋白峰的放射强度占总放射强度的百分率。,影响因素:,被标记物不纯，杂质也被放射性核素标记；,标记后的分离纯化不完全；,标记化合物贮存过程中的碘脱落。,(2) 比放射性,或称放射性比度,是单位质量标记物的放射强度，单位为Bq/,g。标记抗原的比放射性越高，所需标记抗原量越少，实验系统的敏感度越高。,但过高的比放射性可能会损伤抗原的免疫活性。如碘标记化合物以单碘标记为宜。,(3) 免疫活性,是指标记抗原结合于抗体的放射强度占总放射强度的百分率。以检查标记后免疫活性损失情况。,方法是加10倍量抗体和标记抗原反应，测定结合部分(B)和游离部分(F)的放射强度，算出B/B+F的百分率，正常应在80%以上，值越大，说明抗原损伤越少;如果值过小，标记抗原应重新强化或废弃重做。,二、抗体选用,抗体也是放射免疫技术试剂盒主要组成试剂之一，常采用含特异性抗体的抗血清和小鼠杂交瘤单克隆抗体。,抗体的质量直接影响分析的灵敏度和特异性。,抗体的质量指标主要有亲和常数、特异性和效价。,三、免疫复合物分离技术,在放射免疫技术的反应系统中，因抗原和抗体含量极微，所形成的免疫复合物不发生沉淀。必须采用适当方法将反应平衡时,Ag- Ab复合物（B）和游离Ag（F）分开，才能分别测量其放射性。,理想的分离技术符合条件,简便易行，适于大批量样品分析;,分离效果完全、快速，非特异结合低;,试剂来源容易、价格低廉、稳定性好、可长期保存;,不受外界因素和样品中其他组分的干扰，对标准品和待测抗原分离效果相同;,适合自动化分析的要求。,目前尚无完全满足上述条件的分离方法,免疫复合物分离常用方法,1.吸附法 是用吸附剂 (如活性炭)吸附小分子的游离。,2.化学沉淀法 RIA反应条件接近抗体的等电点，加入聚乙二醇(PEG)等蛋白质沉淀剂可破坏蛋白分子表面的水化层而使蛋白沉淀，从而分离B与F。,3.双抗体法 利用抗抗体和,Ag-Ab复合物中的抗体结合，形成更大免疫复合物，离心沉淀即可分离B与F。,4PR试剂 将双抗体法和PEG结合起来的沉淀法，可弥补各自的不足，分离效果好，适用范围广。,5固相分离法 将抗体或抗原结合在固相载体（如磁颗粒、聚苯烯管子或珠等）上，利用固相抗体或抗原分离B和F，具有简便、快速、适合于自动化分析等特点，已逐步取代传统的液相分离方法。,核射线探测仪器由射线探测器和后续电子学单元两大部分组成。核射线探测器是个能量转化器，其检测原理是当射线作用于闪烁体，闪烁体吸收了射线的能量而引起闪烁体中的原子或分子激发，当受激的原子或分子退激时，则发出光子进入光电倍增管光阴极，转换为光电子，光电子在光电倍增管电场作用下到达阳极，形成电脉冲。转换模式是放射能光能电能脉冲。,第二节 放射免疫分析,该项技术是由1959年美国Berson和Yalow首先以放射性碘标记胰岛素测定血清中胰岛素含量而建立起来的。开创了体外微量物质检测新纪元。,于1977年获诺贝尔生物医学奖。,一、原 理,其基本原理是抗原抗体竞争性结合反应，即待测抗原(Ag)和定量的标记抗原(,Ag)与限量的抗体(Ab)进行特异性反应，其中Ab的结合位点数小于Ag,Ag的结合位点总数，则Ag和,Ag与Ab发生竞争性结合。如待测Ag含量多，则Ag-Ab复合物形成得多，,Ag-Ab复合物 (B)形成少，游离的,Ag（F）多，反之亦然（图19-1）。,二、技术要点,1.抗原抗体反应为待测抗原和抗原标准品与抗体的竞争性结合反应。,根据加样顺序不同，RIA可分为2个类型：,平衡法 将Ag和Ag同时与Ab反应，达到平衡后分离Ag-Ab和Ag，方法稳定，但敏感度稍差；,顺序饱和法 先将待测Ag与Ab充分反应，达平衡后再加入Ag，敏感度提高，稳定性不如平衡法。,2.B/F分离 B/F 分离技术如第一节所述，具体操作中应注意 B/F 分离好坏是实验成功的关键，为了使测量结果能代表反应结果，要求分离方法能使B和F得以完全有效地分开，且要求分离不破坏已经达到动态平衡的免疫反应。因此常常要求提高分离速度、降低操作温度、缩短分离剂和反应系统的接触时间等。,3.放射性强度测定根据放射性核素的类型分别选用液体闪烁计数仪（型）和计数仪（型），测定各待测标本和备抗原标准品的,Ag-Ab放射性强度 (B)或游离,Ag放射性强度 (F)。,(1) 标准曲线制作： 制作标准曲线时，纵坐标为放射性反应参数，有各种表示方式，可选用B/F、B/T、F/B、B/B,0,等比值或B或F的cpm值，常选用B/B,0,比值作为参数。横坐标为已知测定物标准品的浓度，以算术数或对数表示。放射免疫分析的标准曲线为双曲线(图19-2),RIA标准曲线的类型,（1）以测定物标准品浓度为横坐标，B%或B/F、B/B0、计数（cpm）,为纵坐标，呈双曲函数；,（2）以测定物标准品浓度的对数为横坐标，B%或B/F、B/B0、cpm为,纵坐标，曲线呈反S型；,(3）以标准品浓度的算术数（或对数）为横坐标，F/B（或B0/B）,为纵坐标，呈双曲函数；,（4）以标准品浓度的对数为横坐标， logitB/B0为纵坐标，,标准曲线为从左到右的渐降直线。,(2)抗原含量计算 根据待测抗原管的放射性强度计算相应反应参数值，再从标准曲线图上查得待测抗原相应含量。,三、方法学评价,RIA优点敏感度高，能测到g/L，甚至可测到ng/L或pg/水平；特异性强，与结构类似物质间的交叉反应少；准确性好，重复性好，批间批内误差低；用血量少。,RIA缺点有放射性核素对环境和实验室污染； 放射性核素易衰变以及放射性标记物不稳定，导致试剂有效期短。,第二节 免疫放射技术,1968年Miles和Hales应用同位素标记的抗胰岛素抗体检测牛血清中胰岛素获得成功。,IRMA的灵敏度明显高于RIA。,一、原理,免疫放射分析的原理属于非竞争性免疫结合反应。是将放射性同位素标记在抗体上，用过量的标记抗体(Ab)与待测抗原反应，反应式为Ag+,Ab=Ag-,Ab+,Ab。待充分反应后，除去游离的标记抗体，Ag-,Ab结合物的放射性强度与待测抗原量呈正比关系，即待测抗原含量越多，则复合物的计数率就越高，反之则越低。其反应式如下：,Ag + Ab*(过量) Ag-Ab* + Ab*,IRMA方法学,单点IRMA法（图19-3）,双位点IRMA法（图19-4）,单位点IRMA原理示意图,双位点IRMA原理示意图,二、技术要点,1抗原抗体反应 向已包被抗体的反应管（包被试管或包被珠）中加入待测抗原和标记抗体,进行抗原抗体结合反应，在一定的温度下温育，使反应达到平衡。,2B/F分离 采用固相分离法，洗涤或吸弃上清液，除去未结合的游离标记抗体。,3放射性强度测定 除去游离标记抗体后，测定反应管中放射性强度,4数据处理 反应管中放射性强度即代表与抗原结合的标记抗体量。IRMA复合物放射性强度与待测抗原量呈正比，用抗原标准品绘制标准曲线，可得待测抗原量。,三、方法评价,优点,1敏感性高,2特异性高,3标记物稳定，标记容易。,4结果稳定,