第二章_紫外可见分光光度分析法 课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第二章 紫外-可见分光光度分析法,第一节 基本原理,第二节 紫外-可见分光光度计,第三节 显色与测量条件的选择,第四节 分光光度测定方法,ultraviolet visible spectrophotometers,第二章 紫外-可见分光光度分析法,一、概述,二,、紫外可见吸收光谱,三、分子吸收光谱与电子跃迁,四、光的吸收定律,第一节 基本原理,一、概述,基于物质光化学性质而建立起来的分析方法称之为光化学分析法。 分为:光谱分析法和非光谱分析法。,光谱分析法是指在光（或其它能量）的作用下，通过测量物质产生的发射光、吸收光或散射光的波长和强度来进行分析的方法。,吸收光谱分析,发射光谱分析,分子光谱分析,原子光谱分析,概述:,在光谱分析中，依据物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法称为吸光光度法,主要有:,红外吸收光谱：,分子振动光谱，吸收光波长范围2.5,1000 ,m ,主要用于有机化合物结构鉴定。,紫外吸收光谱：,电子跃迁光谱，吸收光波长范围200,400,nm（,近紫外区） ，可用于结构鉴定和定量分析。,可见吸收光谱：,电子跃迁光谱，吸收光波长范围,400750,nm ，,主要用于有色物质的定量分析。,本章主要讲授紫外可见吸光光度法。,二、紫外可见吸收光谱,1光的基本性质,光是一种电磁波，具有波粒二象性。光的波动性可用波长,、频率,、光速,c,、,波数（,cm,-1,）,等参数来描述：, =,c,；,波数 = 1/,=,/,c,光是由光子流组成，光子的能量：,E = h, =,h c /,（,Planck,常数,：,h,=6.626,10,-34,J,S,),光的波长越短（频率越高），其能量越大。,白光(太阳光)：由各种单色光组成的复合光,单色光,：单波长的光(由具有相同能量的光子组成),可见光区,：400-7,60 nm,紫外光区,：近紫外区200 - 400,nm,远紫外区10 - 200,nm （,真空紫外区）,辐射区段,波长范围,原子或分子的主要能级跃迁,射线,X,射线,远紫外辐射,紫外辐射,可见光,近红外辐射,中红外辐射,远红外辐射,微波,无线电波,10,-3,0.1 nm,0.110 nm,10200 nm,200400 nm,400760 nm,0.762.5,m,2.550,m,50300,m,0.3mm1 m,11000 m,原子核反应,原子内层电子跃迁,分子中原子的中壳层电子能级跃迁,分子中原子外层价电子能级跃迁,分子中原子外层价电子能级跃迁,分子中涉及氢原子的振动能级跃迁,分子中原子的振动能级和分子转动能级跃迁,分子转动能级跃迁,分子转动能级跃迁,磁场诱导核自旋能级跃迁,电磁波谱分区表,2. 物质对光的选择性吸收及吸收曲线,M +,热,M +,荧光或磷光,E,=,E,2,-,E,1,=,h,量子化 ；选择性吸收;,分子结构的复杂性使其对不同波长光的吸收程度不同；,用不同波长的单色光照射，测吸光度,吸收曲线与最大吸收波长,max,；,M +,h, M,*,光的互补,：蓝,黄,基态 激发态,E,1,（,E,）,E,2,白色,620760nm,590620nm,400430nm,560590nm,500560nm,480500nm,430480nm,红,黄,绿,橙,青,青蓝,紫,蓝,吸收曲线的讨论：,（1）同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光度最大处对应的波长称为,最大吸收波长,max,（2）不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似,max,不变。而对于不同物质，它们的吸收曲线形状和,max,则不同。,（3）吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的依据之一。,（4）,不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸光度,A,有差异，在,max,处吸光度,A,的差异最大。此特性可作为物质定量分析的依据。,（5）,在,max,处吸光度随浓度变化的幅度最大，所以测定最灵敏。吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。,3.紫外,可见分子吸收光谱与电子跃迁,物质分子内部三种运动形式：,（,1）电子相对于原子核的运动,（2）原子核在其平衡位置附近的相对振动,（3）分子本身绕其重心的转动,分子具有三种不同能级：电子能级、振动能级和转动能级,三种能级都是量子化的，且各自具有相应的能量,分子的内能：电子能量,E,e,、,振动能量,E,v,、转动能量,E,r,即,E,E,e,+,E,v,+,E,r,e,v,r,能级跃迁,紫外-可见光谱属于电子跃迁光谱。,电子能级,间跃迁的同时总伴随有振动和转动能级间的跃迁。即电子光谱中总包含有振动能级和转动能级间跃迁产生的若干谱线而呈现宽谱带。,讨论：,（1）转动能级间的能量差,E,r,：0.0050.050,eV,，,跃迁产生吸收光谱位于远红外区。远红外光谱或分子转动光谱；,（2）振动能级的能量差,E,v,约为：0.05,eV,，,跃迁产生的吸收光谱位于红外区，红外光谱或分子振动光谱；,（3）电子能级的能量差,E,e,较大120,eV,。,电子跃迁产生的吸收光谱在紫外,可见光区，紫外,可见光谱或分子的电子光谱,讨论：,（4）吸收光谱的波长分布是由产生谱带的跃迁能级间的能量差所决定，反映了分子内部能级分布状况，是物质定性的依据。,（5）,吸收谱带强度与分子偶极矩变化、跃迁几率有关，也提供分子结构的信息。通常将在最大吸收波长处测得的摩尔吸光系数,max,也作为定性的依据。,不同物质的,max,有时可能相同，但,max,不一定相同,；,（6）吸收谱带强度与该物质分子吸收的光子数成正比，定量分析的依据。,三、分子吸收光谱与电子跃迁,紫外,可见吸收光谱,有机化合物的紫外可见吸收光谱，是其分子中外层价电子跃迁的结果（三种）：,电子、,电子、,n,电子,。,分子轨道理论,：,一个成键轨道必定有一个相应的反键轨道。通常外层电子均处于分子轨道的基态，即成键轨道或非键轨道上。,外层电子吸收紫外或可见辐射后，就从基态向激发态(反键轨道)跃迁。主要有四种跃迁所需能量,大小顺序为：,n, ,n,跃迁,所需能量最大，,电子只有吸收远紫外光的能量才能发生跃迁。饱和烷烃的分子吸收光谱出现在远紫外区(吸收波长,200nm。,这类跃迁在跃迁选律上属于禁阻跃迁，摩尔吸光系数一般为10100,Lmol,-1,cm,-1,，,吸收谱带强度较弱。分子中孤对电子和,键同时存在时发生,n,跃迁。丙酮,n,跃迁的,为275,nm,max,为22,Lmol,-1,cm,-1,（,溶剂环己烷)。,生色团与助色团,生色团：,最有用的紫外可见光谱是由,和,n,跃迁产生的。这两种跃迁均要求有机物分子中含有不饱和基团。这类含有,键的不饱和基团称为生色团。简单的生色团由双键或叁键体系组成，,如乙烯基、羰基、亚硝基、偶氮基,NN、,乙炔基、腈基,C,N,等,。,助色团：,有一些含有,n,电子的基团,(,如,OH、OR、NH,、NHR、X,等,)，,它们本身没有生色功能(不能吸收,200nm,的光)，但当它们与生色团相连时，就会发生,n,共轭作用，增强生色团的生色能力(吸收波长向长波方向移动，且吸收强度增加)，这样的基团称为助色团。,红移与,蓝移,有机化合物的吸收谱带常常因引入取代基或改变溶剂使最大吸收波长,max,和吸收强度发生变化:,max,向长波方向移动称为红移，向短波方向移动称为蓝移 (或紫移)。吸收强度即摩尔吸光系数,增大或减小的现象分别称为增色效应或减色效应，如图所示。,四、光的吸收定律,1.朗伯,比耳定律,布格(,Bouguer,),和朗伯(,Lambert),先后于1729年和1760年阐明了光的吸收程度和吸收层厚度的关系。,A,b,1852年比耳(,Beer),又提出了光的吸收程度和吸收物浓度之间也具有类似的关系。,A,c,二者的结合称为朗伯,比耳定律，其数学表达式为：,朗伯,比耳定律数学表达式,A,lg（,I,0,/,I,t,)=,b c,式中,A,：,吸光度；描述溶液对光的吸收程度；,b,：,液层厚度(光程长度)，通常以,cm,为单位；,c,：,溶液的摩尔浓度，单位,molL,；,：,摩尔吸光系数，单位,Lmol,cm,；,或:,c,：,溶液的浓度，单位,g100mL,：,吸光系数，单位,100mLg,cm,与,的关系为：,（,M,为摩尔质量）,透光度(透光率),T,透过度,T,: 描述入射光透过溶液的程度:,T,=,I,t,/,I,0,吸光度,A,与透光度,T,的关系:,A, ,lg,T,朗伯比耳定律是吸光光度法的理论基础和定量测定的依据。应用于各种光度法的吸收测量；,摩尔吸光系数,在数值上等于浓度为1,mol/L、,液层厚度为1,cm,时该溶液在某一波长下的吸光度；,吸光系数 相当于浓度为1,g/100mL、,液层厚度为1,cm,时该溶液在某一波长下的吸光度。,2.摩尔吸光系数,的讨论,（1）,吸收物质在一定波长和溶剂条件下的,特征常数,；,（2）,不随浓度,c,和光程长度,b,的改变而改变,。在温度和波长等条件一定时，,仅与吸收物质本身的性质有关，与待测物浓度无关；,（3）,可作为,定性鉴定的参数,；,（4）,同一吸收物质在不同波长下的,值是不同的。在最大吸收波长,max,处的摩尔吸光系数，常以,max,表示。,max,表明了该,吸收物质最大限度的吸光能力,，也反映了光度法测定该物质可能达到的最大灵敏度。,摩尔吸光系数,的讨论,（5）,max,越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测定该物质的灵敏度越高。,10,5,：超高灵敏；,=(610）10,4,：高灵敏；,210,4,：不灵敏。,（,6）,在数值上等于浓度为1,mol/L、,液层厚度为1,cm,时该溶液在某一波长下的吸光度。,3.偏离朗伯,比耳定律的原因,标准曲线法测定未知溶液的浓度时，发现：标准曲线常发生弯曲（尤其当溶液浓度较高时），这种现象称为对朗伯,比耳定律的偏离。,引起这种偏离的因素（两大类）：,（1）,物理性因素，即仪器的非理想引起的；,（2）,化学性因素。,（1）,物理性因素,难以获得真正的纯单色光,。,朗,比耳定律的前提条件之一是入射光为单色光。,分光光度计只能获得近乎单色的狭窄光带。复合光可导致对朗伯,比耳定律的正或负偏离。,非单色光、杂散光、非平行入射光都会引起对朗伯,比耳定律的偏离，最主要的是非单色光作为入射光引起的偏离,。,(2) 化学性因素,朗比耳定律的假定：所有的吸光质点之间不发生相互作用；,假定只有在稀溶液(,c,10,2,mol/L,时，吸光质点间可能发生缔合等相互作用，直接影响了对光的吸收。,故：朗伯比耳定律只适用于稀溶液,。,溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物的形成等化学平衡时。使吸光质点的浓度发生变化，影响吸光度。,例： 铬酸盐或重铬酸盐溶液中存在下列平衡：,CrO,4,2-,2,H,=,Cr,2,O,7,2-,H,2,O,溶液中,CrO,4,2-,、 Cr,2,O,7,2-,的颜色不同，吸光性质也不相同。故此时溶液,pH,对测定有重要影响。,(3),偏离比尔定律的其他因素,1.,待测组分的浓度过高,2.,谱带宽度过大,3. pH,值的影响,4.,杂质的影响,5.,光散射的影响,第二章 紫外,可见分光光度法,一、基本组成,二、分光光度计的类型,第二节 紫外,可见分光光度计,仪器,可见分光光度计,仪器,紫外-可见分光光度计,一、基本组成,光源,单色器,样品室,检测器,显示,1. 光源,在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。,可见光区：钨灯作为光源，其辐射波长范围在3202500,nm。,紫外区：氢、氘灯。发射185400,nm,的连续光谱。,2.单色器,将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任波长单色光的光学系统。,入射狭缝：光源的光由此进入单色器；,准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束；,色散元件：将复合光分解成单色光；,棱镜或光栅,；,聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝；,出射狭缝。,3. 样品室,样品室放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。,在紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池。,4. 检测器,利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的有光电池、光电管或光电倍增管。,5. 结果显示记录系统,检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理,二、分光光度计的类型,1.单光束,简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。,2.双光束,自动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。仪器复杂，价格较高。,3.双波长,将不同波长的两束单色光(,1,、,2,),快束交替通过同一吸收池而后到达检测器。产生交流信号。无需参比池。,=,12,nm,。,两波长同时扫描即可获得导数光谱。,第二章 紫外-可见分光光度法,一、,显色反应的选择,二、显色反应条件的选择,三、共存离子干扰的消除,四、测定条件的选择,五、提高光度测定灵敏度和选择性的途径,第三节 显色与测量条件的选择,一、,显色反应的选择,1.选择显色反应时，应考虑的因素,灵敏度高、选择性高、生成物稳定、,显色剂在测定波长处无明显吸收,，两种有色物最大吸收波长之差：,“,对比度,”,，,要求, 60,nm,。,2.配位显色反应,当金属离子与有机显色剂形成配合物时，通常会发生电荷转移跃迁，产生很强的紫外可见吸收光谱。,3.氧化还原显色反应,某些元素的氧化态，如,Mn（）、Cr,（）,在紫外或可见光区能强烈吸收，可利用氧化还原反应对待测离子进行显色后测定。,例如：钢中微量锰的测定，,Mn,2,不能直接进行光度测定,2,Mn,2,5 S,2,O,8,2-,8 H,2,O =2 MnO,4,+ 10 SO,4,2-, 16H,+,将,Mn,2,氧化成紫红色的,MnO,4,后,，,在525,nm,处进行测定。,4.显色剂,无机显色剂：,硫氰酸盐、钼酸铵、过氧化氢等几种。,有机显色剂：,种类繁多,偶氮类显色剂,：,本身是有色物质，生成配合物后，颜色发生明显变化；具有性质稳定、显色反应灵敏度高、选择性好、对比度大等优点，应用最广泛。偶氮胂、,PAR等,。,三苯甲烷类,：,铬天青S、二甲酚橙等,二、显色反应条件的选择,1.显色剂用量,吸光度,A,与显色剂用量,C,R,的关系会出现如图所示的几种情况。选择曲线变化平坦处。,2.反应体系的酸度,在相同实验条件下，分别测定不同,pH,值条件下显色溶液的吸光度。选择曲线中吸光度较大且恒定的平坦区所对应的,pH,范围。,3.显色时间与温度,实验确定,4.溶剂,一般尽量采用水相测定，,三、共存离子干扰的消除,1.加入掩蔽剂,选择掩蔽剂的原则是：掩蔽剂不与待测组分反应；掩蔽剂本身及掩蔽剂与干扰组分的反应产物不干扰待测组分的测定。 例：测定,Ti,4,，,可加入,H,3,PO,4,掩蔽剂使,Fe,3+,(,黄色)成为,Fe(PO,),2,3-,(,无色)，消除,Fe,3+,的干扰；又如用铬天菁,S,光度法测定,Al,3+,时，加入抗坏血酸作掩蔽剂将,Fe,3+,还原为,Fe,2+,，,消除,Fe,3+,的干扰。,2.选择适当的显色反应条件,3.分离干扰离子,四、测定条件的选择,1.选择适当的入射波长,一般应该选择,max,为入射光波长。,如果,max,处有共存组分干扰时，则应考虑选择灵敏度稍低但能避免干扰的入射光波长。,2.选择合适的参比溶液,为什么需要使用参比溶液？,测得的的吸光度真正反映待测溶液吸光强度。,参比溶液的选择一般遵循以下原则：, 若仅待测组分与显色剂反应产物在测定波长处有吸收，其它所加试剂均无吸收，用纯溶剂（水)作参比溶液；, 若显色剂或其它所加试剂在测定波长处略有吸收，而试液本身无吸收，用,“,试剂空白,”,(不加试样溶液)作参比溶液；,参比溶液的选择一般遵循以下原则：, 若待测试液在测定波长处有吸收，而显色剂等无吸收，则可用,“,试样空白,”,(不加显色剂)作参比溶液；, 若显色剂、试液中其它组分在测量波长处有吸收，则可在试液中加入适当掩蔽剂将待测组分掩蔽后再加显色剂，作为参比溶液。,3.控制适宜的吸光度（读数范围）,不同的透光度读数，产生的误差大小不同：,lg,T,=,bc,微分：,dlg,T,0.434dln,T,= - 0.434,T,-1,d,T,=,b,d,c,两式相除得：,d,c,/,c,= （ 0.434 /,T,lg,T,）,d,T,以有限值表示可得：,c,/,c,=（0.434/,T,lg,T,）,T,浓度测量值的相对误差（,c,/,c,）,不仅与仪器的透光度误差,T,有关，而且与其透光度读数,T,的值也有关。,是否存在最佳读数范围？何值时误差最小？,最佳读数范围与最佳值,设：,T,=1%，,则可绘出溶液浓度相对误差,c,/,c,与其透光度,T,的关系曲线。如图所示：,当：,T,=1%，,T,在20%65%之间时，浓度相对误差较小，,最佳读数范围,。,可求出浓度相对误差最小时的透光度,T,min,为：,T,min,36.8%,A,min,0.434,用仪器测定时应尽量使溶液透光度值在,T,%=2065% (,吸光度,A,=0.700.20)。,第二章 紫外-可见分光光度法,一、普通分光光度法,二、示差分光光度法,三、双波长分光光度法,四、导数分光光度法,第四节 分光光度测定方法,一、普通分光光度法,1.单组分的测定,通常采用,A-C,标准曲线法定量测定。,2.多组分的同时测定, 若各组分的吸收曲线互不重叠，则可在各自最大吸收波长处分别进行测定。这本质上与单组分测定没有区别。, 若各组分的吸收曲线互有重叠，则可根据吸光度的加合性求解联立方程组得出各组分的含量。,A,1,=,a1,bc,a,b1,bc,b,A,2,=,a2,bc,a,b2,bc,b,二、双波长分光光度法,不需空白溶液作参比；但需要两个单色器获得两束单色光(,1,和,2,)；,以参比波长,1,处的吸光度,A,1,作为参比，来消除干扰。在分析浑浊或背景吸收较大的复杂试样时显示出很大的优越性。灵敏度、选择性、测量精密度等方面都比单波长法有所提高。,A,A,2,A,1, (,2,1,),b c,两波长处测得的吸光度差值,A,与待测组分浓度成正比。,1,和,2,分别表示待测组分在,1,和,2,处的摩尔吸光系数。,关键问题:,测量波长,2,和参比波长,1,的选择与组合,以两组分,x,和,y,的双波长法测定为例：,设：,x,为待测组分，,y,为干扰组分，二者的吸光度差分别为:,A,x,和,A,y,，,则该体系的总吸光度差,A,x+y,为：,A,x+y,=,A,x,+,A,y,如何选择波长,1,、,2,有一定的要求。,选择波长组合,1,、,2,的基本要求是：,选定的波长,1,和,2,处干扰组分应具有相同吸光度，,即：,A,y,=,A,y,2,A,y,1,= 0,故：,A,x+y,=,A,x=(,x,2,x,1,),bc,x,此时：测得的吸光度差,A,只与待测组分,x,的浓度呈线性关系，而与干扰组分,y,无关。若,x,为干扰组分，则也可用同样的方法测定,y,组分。,可采用作图法选择符合上述两个条件的波长组合,。,在选定的两个波长,1,和,2,处待测组分的吸光度应具有足够大的差值。,三、导数分光光度法,导数分光光度法在多组分同时测定、浑浊样品分析、消除背景干扰、加强光谱的精细结构以及复杂光谱的辨析等方面，显示了很大的优越性。,利用吸光度(或透光度)对波长的导数曲线来进行分析：,0,e,-,bc,假定入射光强度,0,在整个波长范围内保持恒定：,d,I,0,/d,0,则,：,d,I,/d,0,bc,e,-,bc,d,/d,0,bc,d,/d,导数分光光度法,d,I,/d,0,bc,d,/d,一阶导数信号与试样浓度呈线性关系；,测定灵敏度依赖于摩尔吸光系数对波长的变化率,d,/d,。吸收曲线的拐点处,d,/d,最大，故其灵敏度最高(见图）。,同理可以导出其二阶和三阶导数光谱（略）,