细胞凋亡作用机理

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,细胞衰老与细胞凋亡,衰老和死亡是生命的基本现象，生命要不断的更新，种族要不断的繁衍。 而这种过程就是在生与死的矛盾中进行的。至少从细胞水平来看，死亡是不可避免的。 衰老过程发生在生物界的整体水平、种群水平、个体水平、,细胞水平,以及分子水平等不同的层次。,衰老是细胞的一种重要的生命活动。,100,多年前,1960s,Hayflick,界限,第,1,节 细胞衰老,（,CELL AGING, CELL SENESCENCE,）,细胞衰老的研究,成人早衰症,（,Werner,氏综合症）,婴幼儿早衰症,（,Hayflick-Guilford,综合症 ）,决定细胞衰老的因素在细胞内部，,而不在外部环境。,决定细胞衰老的表达是细胞核而,不是细胞质。,（长寿基因和衰老基因）,细胞在体内条件下的衰老,衰老细胞结构的变化,细胞核：,核膜的内折，染色质固缩化,内质网：,有序排列被破坏，弥散于核周胞质中,糙面内质网解体，减少。,线粒体：,数目减少，体积增大,;,有时可看到嵴。,致密体：,积累增多（是由溶酶体或线粒体转化）,膜系统的变化：,凝胶相或固相，通透性和流动性降低,细胞间间隙连接减少,组成间隙连接的膜内颗粒聚集体变小,衰老症状,原因分析,皮肤干燥、发皱,头发变白,老人斑,吸收能力下降,细胞水分减少，体积减小,细胞内的,酶,活性降低,细胞内色素,(,脂褐素,),的累积,细胞,膜通透性,功能改变,无力,细胞内,呼吸,速度减慢,衰老症状与原因分析,就生物个体而言，在其整个的生长发育过程中也不断地发生细胞选择性地死亡，这对保证机体的生存，保持机体对内外环境变化的适应能力，维持其正常的发育均具有重要意义。此种细胞死亡称为,编程性细胞死亡,（,programmed cell death，PCD），也称,细胞凋亡（,apoptosis）,。,编程性细胞死亡,细胞凋亡（,apoptosis）,由基因控制的自主性有序死亡，亦称程序性死亡,(programmed cell death,PCD),Apo-ptosis,来源于希腊语，,from fall,;,细胞的死亡犹如秋天树叶的凋落,1965,年,Kerr,J.F.R.,对大鼠肝脏门静脉结扎后肝细胞溶酶体的观察,(J Pathol. Bacteriol. 90:419,1965),1972,年澳大利亚,Kerr,和,Curry,提出,* 线虫(C.elegant)中的细胞程序性死亡,线虫,:,成体,959,个细胞,但在发育过程中有,131,个细胞会注定发生,PCD,PCD,发生时间,:1h,左右,参与线虫,PCD,的基因，目前已知的有,14,个,凋亡的回顾,(programmed cell death, PCD),经典凋亡模型,PCD已经提出20多年了，但是发现其生物学上的重大意义还是近年的事。PCD和遗传、进化、发育、病理及至肿瘤的发生、发展及其放疗、化疗等均有密切的关系。,年诺贝尔生理学或医学奖分别授予了英国科学家悉尼,布雷内、美国科学家罗伯特,霍维茨和英国科学家约翰,苏尔斯顿，以表彰他们发现了在器官发育和,“,程序性细胞死亡,”,过程中的基因规则。,Sydney Brenner,1/3 of the prize,United Kingdom,The Molecular Sciences Institute Berkeley, CA, USA,b. 1927(in Union of South Africa),H. Robert Horvit,1/3 of the prize,USA,Massachusetts Institute of Technology (MIT) Cambridge, MA, USA,b. 1947,John E. Sulston,United Kingdom,The Wellcome Trust Sanger Institute Cambridge, United Kingdom,b. 1942,THE 2002 NOBEL PRIZE WINNER,THE NOBEL DIPlOMA,2002年诺贝尔医学与生理学颁奖仪式，瑞典斯德哥尔摩音乐厅。,Sydney Brenner receiving his Nobel Prize from His Majesty the King at the Stockholm Concert Hall.,Photo: Hans Mehlin, Nobel e-Museum,1.细胞凋亡和一般性衰老死亡区分开来，证明了细胞凋亡的必然性；,2. 基因分析与细胞的分裂、分化以及器官的发育联系起来;,3.细胞凋亡机理为艾滋病、肿瘤和癌症等疾病的治疗提供了寻找新方法的可能。,“,程序性细胞死亡,”,是细胞的一种生理性、主动性的,“,自觉自杀行为,”,，这些细胞死得有规律，似乎是按编好了的,“,程序,”,进行的，其死亡过程犹如秋天片片树叶的凋落，所以这种细胞死亡又称为,“,细胞凋亡,”,。,包括人类在内的生物是由细胞组成的，细胞的诞生固然非常重要，但细胞的死亡也重要。,早在世纪年代初期，科学家就开始探索,“,程序性细胞死亡,”,的奥秘。但要揭开这一奥秘，需要选择一个合适的研究对象，像细菌这样的单细胞生物太简单，而像哺乳动物这样由大量细胞组成的生物又太复杂，科学家最终选择了,线虫,。线虫长仅毫米，细胞数量不多，功能也不复杂，而且它身体透明，便于用显微镜观测。,这位获奖者的成果为其他科学家研究,“,程序性细胞死亡,”,提供了重要基础，后来科学家又在这一领域取得了一系列新成绩。科学家们发现，控制,“,程序性细胞死亡,”,的基因有两类，一类是抑制细胞死亡的，另一类是启动或促进细胞死亡的。两类基因相互作用控制细胞正常死亡。,如果能发现所有的调控基因，分析其功能，研究出能发挥或抑制这些基因功能的药物，那么就可加速癌细胞自杀，达到治疗癌症的目的，而同时提高免疫细胞的生命力，则达到抵御艾滋病的目的。,细胞凋亡与坏死的区别,1细胞凋亡,细胞凋亡多发生于生理情况下，故可称为生理性死亡，部分病理刺激也可诱导凋亡。,其特征为,1.细胞骨架的扰乱，粘附力降低，伴随细胞皱缩而产生的胞质和核的浓缩;,2.膜发泡;,3.核中沿核周缘染色质凝集，继而染色质降解，凝胶电泳检测呈现180200bp及其倍数的特征梯度（ladder）;,4.形成膜包围的断裂片段的凋亡小体（,apoptosis bodies）.,膜通透性增高，细胞水肿，内质网膨胀，线粒体膨胀破裂，酶被释放，染色质凝集，核固缩，细胞溶解，胞质内容物释放，导致炎症反应。,2细胞坏死,细胞坏死（,necrosis）是区别于细胞凋亡的另一种细胞死亡方式，由多种致病因子如局部缺血，物理、化学和生物因子的作用而产生的急性损伤所致，故称为病理性死亡。,细胞凋亡与坏死的比较,坏死 凋亡,强刺激,弱刺激,溶酶释出，炎症反应,ATP(,-),ATP,Apoptotic bodies （凋亡小体）,哺乳类的细胞凋亡过程,-Apoptosis,检测细胞凋亡的方法,组织切片中的凋亡细胞分散，数量少，迅速为巨噬细胞所吞食。Giemsa 染色、孚尔根染色或Hoechest 33342等荧光染色。在光镜下镜检、可观察到染色质凝集、边缘化，凋亡小体出现，巨噬细胞的吞食等现象。,1形态学,组织切片中坏死灶周围有炎症反应，淋巴细胞集中。,死亡,凋亡,在小鼠肌肉中生长的,P815肿瘤细胞中因缺血诱导的坏死，示浓缩的染色质块的病态的边缘、膨胀的线粒体和分解的膜。,孚尔根染色、,DNA荧光染色可显示染色质凝集、断片等现象。,台盼蓝染色，凋亡细胞仍是拒染而坏死细胞是着色的，表明凋亡细胞还保持着一定生物活性。坏死细胞胞质不浓缩而是明显肿胀，无凋亡小体。,电镜下凋亡细胞的核缩小，染色质边缘化、凝集、电子密度高。晚期则形成核碎片和胞质内的细胞器混合在一起被细胞膜包围的凋亡小体；内质网到后期膨胀成泡状，胞质密度增高， 胞膜绒毛减少；凋亡小体最后脱离胞体，被巨噬细胞所吞噬。,正常细胞核,凋亡细胞核,细胞发生凋亡时，染色质会固缩。 所以,Hoechst染色时，细胞核会呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染。,返回,前进,Apoptosis of ANA-1 cell induced by Curcumin,?,Human lymphoma cells treated with the chemotherapy agent camptothecin. The cells that are undergoing apoptosis appear yellow and show the characteristic membrane blebbing (bubble formation)seen in cells dying via apoptosis.,线虫,(,C. clegans,)凋亡细胞是自身cdc3和ced4基因表达依赖性的，凋亡细胞被邻近细胞吞食。,2DNA电泳,提取细胞基因组,DNA，通过琼脂糖凝胶电泳，凋亡细胞DNA显示出180200bp及其不同倍数的梯带，被视为最典型的凋亡指标。因被激活的核酸内切酶选择性地在核小体的连接段（linker）处切断所致。坏死细胞DNA则被核酸内切酶无规则地切断，在培养液中细胞溶解后放出DNA片段，故在电泳胶上呈弥散的涂抹状。,DNA电泳,+,necrosis,apoptosis,3流式细胞光度术,由于核酸内切酶对DNA的降解成小片段，通过固定改变膜通透性，经PI或Hoechest33342染色，G,1,期出现低于,2C DNA含量的峰，成为细胞凋亡的重要标志之一。,全反式维甲酸处理人,HL-60细胞后，流式细胞光度仪对细胞DNA含量分析药物处理后第5、6天明显出现G,l,期小峰,4凋亡细胞的原位标记,由于凋亡细胞DNA为核酸内切酶降解产生3OH的缺口和末端，故可用原位缺口平移法(in situ nick translation)或原位末端标记法 （TUNEL）显示凋亡细胞。根据需要可采用生物素、地高辛、荧光素和同位素等标记物，如标记的荧光素可以在流式细胞仪上进行定量分析凋亡与非凋亡细胞。原位标记法的最大优点在于，能在组织切片上识别难于判断的凋亡细胞，不足之处为缺乏专一性，但可结合形态学予以正确判断。,HL-60 cells（急粒，p53缺陷）被喜树碱诱导3小时。DNA段端被荧光标记的脱氧核苷酸末端转移酶标记。,5细胞膜磷脂酰丝氨酸（PS）荧光显示,PS在非凋亡细胞中分布于细胞内膜，细胞凋亡后，细胞内膜转至膜外，PS被巨噬细胞识别后被吞噬。而PS出现在细胞膜外，可作为凋亡细胞的标志。,钙结合蛋白(annexin V)依靠Ca2+与PS结合，使用荧光标记的钙结合蛋白(annexin V,fluos)及PI两种荧光可在流式细胞仪上定量地区别凋亡、坏死和正常的细胞。亦可用荧光显微镜鉴定个别的凋亡细胞。,Jurkat 人类白血病T细胞经喜树碱处理，ps外翻，早期凋亡特异性的特征被annexin5检测到。晚期凋亡和坏死细胞被pi染色,confocal microscopy,共聚焦显微镜用于检测凋亡,细胞凋亡的生物学意义,细胞凋亡是机体自我保护机制，是长期遗传、进化的结果，以保证生物的世代延续。,确保正常发育生长：清除多余的细胞,维持内环境稳定：清除受损、突变、,衰老的细胞,积极防御功能：对病毒感染细胞阻止,复制,细胞凋亡的过程,1, 凋亡信号转导：启动信号,Ca,2+,、,cAMP,、 神经酰胺,2, 凋亡基因激活：表达酶类和其他物质,3, 细胞凋亡的执行：核酸内切酶,(DNase),和,Caspases,4, 凋亡细胞的清除：被临近的,M,或其他细胞吞噬分解,凋亡时细胞的主要变化,形态学改变,胞膜空泡化,固缩,出芽,染色质边集,脱接触,凋亡小体,细胞凋亡的生化改变,1,DNA,的片段化：梯状条带形成？,核小体连接区被切开：染色质,300 kb,50kb,180200bp,或其整倍数片段,5min,90min,2 内源性核酸内切酶激活及其作用,由一系列胞内信号转导环节激活，执行染色质,DNA,切割,Caspase 8的激活，需要FADD( Fas associated protein with death domain)Caspase 9 激活，需要通过CARD（caspase-recruitment domain)、Apaf-1、细胞色素c、ATP等多个因子的参与。,细胞色素,C、Apaf-1和pro-caspase 9 组成了“Apoptosome,”,（,凋亡体）,3 凋亡蛋白酶（caspases）的激活及其作用,是一组对底物天冬氨酸部位有特异水解作用，其活性中心富含半胱氨酸的蛋白酶（,c,ysteine-containing,a,spartate-,s,picific,p,rote,ase,）至少有,13,个成员,Cysteine,半胱氨酸,Aspartate,天冬氨酸,spicific protease,caspases功能,灭活细胞凋亡的抑制物,:,如,Bcl-2,水解蛋白质结构，细胞解体，凋亡小体,在凋亡级联反应中水解相关活性蛋白：使其获得或丧失功能,细胞凋亡的调控,细胞凋亡是细胞自杀现象，是受到一定程序的控制的。如细胞接受凋亡信号，通过一系列的信号传递，凋亡有关的正负调节基因的表达，Ca,2+,的变化，酶的激活等，最终导致细胞凋亡。目前发现与细胞凋亡有关的基因有三类，即,促进细胞凋亡的基因,，,抑制细胞凋亡的基因,和,在细胞凋亡过程中表达的基因,。若按基因效应划分，则可分为原癌基因、抑癌基因、病毒基因、生长及其抑制因子基因、细胞受体基因和蛋白激酶基因等。,诱导性因素：激素，生长因子、理化因素、免疫、微生物,细胞凋亡相关因素,抑制性因素：,细胞因子,IL-2，神经生长因子,激素,ACTH、睾酮、雌激素,其它,Zn,2+,、 苯巴比妥、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、,EB病毒、中性氨基酸,细胞凋亡信号的转导,诱导信号,cell,R,神经酰胺,多途径,R,SAPK/JNK,P53 基因,NF-kB,JNK/AP-1途径,激活,bax or 下调bcl-2,ROS,mtDNA,凋亡信号转导系统特点,多样性：不同种类的细胞系统不同,偶联性：与增殖分化的信号系统交叉偶联,同一性：多因素，共用同一系统触发,多途性：同一诱导因素启动多条信号转导途径,凋亡相关基因,抑制凋亡基因：,bcl-2,促进凋亡基因：,fas,，,P53,双向调控基因：,c-myc,，,bclx,1,ced,基因,在线虫中已发现,14个与细胞凋亡相关的基因。其研究得比较深入的有,ced,3,和,ced-4,以及促进细胞凋亡的有关基因。,ced-4,的详细功能尚不十分清楚，但,Ced-3蛋白有530个氨基酸，其中含有约100个氨基酸长度的丝氨酸富含区，提示磷酸化在细胞凋亡中有十分重要的作用。,在哺乳动物中克隆出一个与,ced-3,相似的基因为白细胞介素,1,转化酶,(inter-leukin- 1,converting enzyme，ICE)，是一种底物特异性半胱氨酸蛋白酶，可裂解IL-1-,前体为,1,。,由果蝇,()中克隆出,rpr,(,reaper,)基因，编码65个氨基酸的短链多肽，其迅速表达可诱导细胞凋亡，但并非参加一切细胞的凋亡。其在进化中的保守性有待深入研究。,2,rpr,基因,它定位于人的第18号染色体，在淋巴瘤中极易发生染色体易位(14：18)，使,bcl,-2与14号染色体上,IgH,基因并列而导致过表达。它编码,26kDa的Bcl-2a及22kDa的Bcl-2,蛋白。,bcl-2,是一个不断在扩增的多基因家族的原型,(prototypes)，其在哺乳类中的家族成员有,Bcl,-,，,Mcl,-1，,Bax,，,Bak,，,Bad,，,A,1和,Bik,-1。,3,Bcl,-2,Bcl-2,229aa,构成（鼠,236,）分在线粒体内膜,细胞内膜表面，内质网，核膜等处,* Bcl-2-,B,c,ell,l,ymphoma/leukemia-2,*,Bcl-2,和,C. elegans,中的,ced-9,有很高的同源性，具有促进细胞存活的功能,大量实验证明它是多细胞动物中普遍存在的,“,长寿,”,基因，如神经元寿命长，,bcl,-2的表达则高于其他类型细胞。,*Bcl-2的功能是延长细胞的寿命，而不是刺激细胞的增殖,Bcl-2抗凋亡机制,直接的抗氧化,抑制线粒体释放促凋亡的蛋白质,抑制促凋亡的,Bax,，,Bak,细胞毒作用,抑制,Caspases,激活,维持细胞钙稳态,线虫,C.elegans,和哺乳类细胞的死亡途径比较,它是一个多功能的原癌基因，,c-myc,可促进细胞分裂，参与细胞的转化。,c-myc,存在于核仁，并可结合在特异的,DNA序列上发挥转化因子的作用。它既可诱导细胞凋亡，又可抑制细胞凋亡。,4,c-myc,基因,c-myc,转录调节因子 依赖,GF,Bcl-x Bcl-xl,抑凋亡,Bcl-xs,促凋亡,p53,是肿瘤抑制基因，野生型,p53可诱导细胞凋亡。缺乏,p53,功能的癌细胞若转染,p53,基因并使其过表达,p53时，导致生长抑制。p53诱导细胞周期阻断的能力，长期以来认为其机理是抑制了肿瘤细胞生长，现在认为p53促进细胞凋亡可能是肿瘤生长抑制的主要原因。,5,p53,基因,P53,-,野生型诱导凋亡，在,G1,期发挥卡点功能,有缺陷,DNA,CIP,表达,启动修复,失败,启动凋亡,CIP-cyclin dependent kinase interacting protien-1,P53 = molecular policeman?,G1,S,G2,M,Cyclin A+CDK,Cyckin A+CDK1,Cyclin B,Cyclin D,p53,Bax,+,Bcl-2,molecular policeman?,Blocking IGF+R,Fas,和,Apo,-1是分别从人的T琳巴细胞瘤KT3细胞株及人B细胞淋巴瘤SKW6.4株分离的两个cDNA克隆，序列分析证明两者完全一致，为同一分子。1993年在美国Boston召开的第五届人类白细胞抗原分型国际会议上，正式命名,Apo,-1,Fas,为,CD 95。,6,FasApo,-1,Fas L(Fas ligand)为人和鼠的Fas的配体。激活的T淋巴细胞高表达Fas L。Fas和Fas L结合则诱导细胞凋亡，但如何激活细胞凋亡的机理尚不清楚。,ICE,基因是由哺乳类中克隆出的,cdc-3,的同源基因，,ICE的前体为p45，有p20及p10 2个亚基，p45可能自身参与这一催化过程，(p20p10),2,形成有活性的,ICE I。Rat-1细胞中ICE过量表达可导致细胞凋亡，如将ICE的催化位点Cys 285突变，则细胞不能凋亡。,7,ICE,基因,细胞凋亡的基因调控,2果蝇细胞凋亡基因的调控,各种内外信号通过传导汇集于,rpr，经过它的整合，调节下游基因的活动，如激活ced3ICE或抑制ced9，bcl-2则可诱导凋亡,3哺乳类细胞凋亡的基因调控,(1)Bcl-2、Bcl-2同源蛋白及其结合蛋白：Bcl-2蛋白定位于线粒体、内质网和核膜上，在胚胎组织中广泛表达。,近年来通过生化及分子生物学技术，陆续发现了一系列Bcl-2相关蛋白，其中一些和Bcl-2一样可抑制细胞凋亡，如BcI-XL，Bag-1等：有些则抑制Bcl-2效应，刺激细胞凋亡，如Bax、Bcl-XS、Bad及Bak等。,Bag-1和Bcl-2的共同表达可抑制Fas或细胞毒性T细胞介导的细胞凋亡，而单独的Bcl-2则不能抑制，也许可以解释为什么存在Bcl,2依赖和不依赖的细胞凋亡。,(2)细胞周期、细胞凋亡对肿瘤的发生与发展的调控：许多细胞周期调控基因如,cyclinD3、Rb、c-myc、c-fos、p53,等也是癌基因或抑癌基因。,凋亡和癌症的发生、发展有着密切关系，如,bcl-2为癌基因又可抑制细胞凋亡，p53过去认为是抑癌基因，但也对细胞周期G,1,S，G,2,M检验点(check point)有调控作用，过去认为p53抑制肿瘤生长是由于抑制了细胞周期的进展，现在认识到与p53促肿瘤细胞的凋亡密切相关。,细胞凋亡是机体自身维持稳定的机制，过度的细胞增殖正是因为应该凋亡清除的细胞保留下来，发生癌变而出现失控的增殖。细胞凋亡是多基因正负调控，最后通过最终共同通路而完成，因而，对细胞周期及相关基因的研究，有助于阐明细胞凋亡的机理。,细胞凋亡的恶性网络假说,线粒体,AIF,Caspase,抑制剂,+,Caspase 9酶原,Caspase-9,Caspase3酶原,Caspase-3,蛋白质水解,无活性核,酸内切酶,内切酶激活,DNA断裂,+,+,+,Bcl-2,Ca,2+,apoptosis,？,