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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,（,Immunoassay，IA,）,第七章 免疫分析法,免疫分析法是指以,特异性抗原-抗体,反应为基础的分析方法。,常用于蛋白质、多肽、酶等大分子量物质的测定，也可用于小分子量物质测定。如糖尿病人血浆中的胰岛素含量。,免疫分析法,概述,放射免疫分析,酶免疫分析,第一节 概述,基本原理,基本条件,方法分类,竞争抑制原理,基,本,原,理,抗原,（,Antigen,）,抗体,（,Antibody,),竞争结合,反应,标记抗原,当反应体系中存在着一定限量的特异抗体时，体系中的标记抗原（Ag,）和未标记抗原（Ag）与特异抗体（Ab）发生竞争结合。,基,本,原,理,定 量 基 础,随着加入的Ag的量（S,0,）的增加，便有不同的对应F,和B,的信号值，建立,S,0,量（浓度）与响应值（F,和B,或B,/F,或B,/T,）之间的函数关系,，即标准曲线。,F,B,F*,B*,基,本,原,理,标准竞争抑制曲线的制备,空白生物基质68份,竞争结合达平衡,等量的抗体Ab和标记药物S,不同量的非标记药物S,0,（药物标准品S,0,),用适当方法测定F,或B,以S,0,为横坐标，响应值为纵坐标作图,基,本,原,理,标准竞争抑制曲线,一般坐标,一般坐标,半对数坐标,对数坐标,基,本,原,理,抗原抗体反应必须满足的条件,Ag,与,Ag,（,药物）必须是,相同,的生物活性,物质,所加入,Ag,与,Ab,的量应是,固定,的,Ag,与,Ag,的量之和应,大于,Ab,的结合位点,Ag,、,Ag,及,Ab,须处于,同一反应体系,中,基,本,原,理,抗原抗体反应的基本特点,特异性,（专一性）,一种抗原分子只能与由他刺激产生的抗体发生特异性结合反应。易受到结构近似的化合物的干扰（交叉免疫，,cross reaction,),可逆性,抗原抗体结合反应相对稳定，但可逆，,改变条件，可使结合物解离，结构、性质和活性不变；可用来纯化抗原或抗体。,最适比例性,（可饱和性）,抗原抗体反应具有一定的量比关系。,只有当抗体抗原两者的分子比例合适时，才能发生最强的结合反应,基,本,原,理,总 结 基 本 原 理,基于抗体和药物（抗原）结合时具有的专一性、可逆性和最适比例性，利用未标记抗原（被测药物）同标记抗原（标记药物）之间竞争抗体结合原理，建立药物浓度和响应值之间的函数关系，用于生物样品中的药物分析。,第一节 概述,基本原理,基本条件,方法分类,基,本,条,件,三 种 基 本 试 剂,标记抗原（标记药物）,提供可检测的信号（响应值）,未标记抗原（药物）,制备标准曲线时指药物标准品或对照品,测定时指被测药物 （标准抗原）,特异抗体,标记抗原（药物）和未标记抗原（药物）竞 争结合的蛋白,基,本,条,件,抗 体 的 制 备,半抗原,（Hapten),人工抗原,免疫接种动物,免 疫 原,抗 血 清,只能与特异抗体作用但不引起机体免疫应答的物质,小分子半抗原与大分子载体结合后形成的全抗原，具免疫原性,与大分子载体结合，动物血清蛋白最常用,能刺激机体引起体液及细胞免疫反应的物质,加入福,氏完全佐剂或水剂,家兔、羊、豚鼠,含抗体的血清，一般不将抗体分离,注射,采血,第一节 概述,基本原理,基本条件,方法分类,方,法,分,类,按是否加入分离剂,均相免疫分析,（,Homogeneous Immunoassay,）,在某些免疫反应中，当抗原抗体反应达到平衡后，反应液中结合的标记药物与游离的标记药物中，有一种不产生信号或信号消失，因此,无需将反应液分作两相,，即可在均相溶液中进行测定，故称为均相免疫分析。,非均相免疫分析,（,Heterogeneous Immunoassay,）,在某些免疫反应中，当抗原抗体反应达到平衡后，只有在反应液中加入分离剂，将游离标记药物和结合标记药物分开之后，才能测出各自部分的标记药物浓度，否则测定的是两者的总浓度。由于这种信号的测定,需将反应液分成液固两相后，才能分别测定,，故称为非均相免疫分析。,方,法,分,类,按标记物的种类,方法名称,标记物,备注,放射免疫分析（,RIA,）,放射性同位素,非均相免疫,酶免疫分析（,EIA,）,酶,非均相免疫,均相免疫,荧光免疫分析*（,FIA,）,荧光物质或潜在荧光物质,非均相免疫,均相免疫,化学发光免疫分析（,CLIA,）,化学发光分子,非均相免疫,均相免疫,*荧光偏振免疫分析、荧光淬灭免疫分析、荧光增强免疫分析,第二节 放射免疫分析,（Radioimmunoassay,RIA,),常用标记物,F,与,B,的分离,方法评价,常,用,标,记,物,放 射 性 同 位 素,目前用的最多,125,I：,化学性质活泼，易标记；,放出能量较高的射线，易测定，,用一般的 计数器检测,放射性强度；,标记后易使药物分子抗原性受到影响；,半衰期短，,60,天,3,H：,标记后药物的抗原性不会受到影响；,半衰期长，1216年；,放出的,射线能量低，,用液体闪烁计数仪检测,放射性强度,F,与,B,的,分,离,RIA,属,非均相免疫分析，必须将,游离标记药物与结合标记药物分离，,分离方法均不能影响药物与抗体竞争结合后的平衡状态。,沉淀法,吸附法,固相法,双抗体法,分离方法,F,与,B,的,分,离,原理,将抗体视为普通蛋白质，采用蛋白沉淀剂使,抗体药物复合物沉淀，离心，上层为,F,，,沉淀为,B,，,可测定,B,或,F,。,常用试剂,酸性盐，最常用（,NH,4,）,2,SO,4,优点,快速、简单、价廉。,缺点,不能使,F,与,B,完全分离，形成的沉淀物对放射性标,记抗原有非特异性吸附，因而空白值较高,沉 淀 法,F,与,B,的,分,离,原理：,利用吸附剂的吸附性,常用试剂：,右旋糖酐包裹的活性炭（,DCC,）,DCC,法原理,：,利用活性炭的强吸附性和右旋糖酐的分子筛作用，使吸附具有选择性，游离药物可通过分子筛被吸附，结合药物因分子体积大，不能被吸附。上清液为,B,，,沉淀为,F,。,优点：,快速、简便。,缺点：,药物,-,抗体结合物离解常数较高时，测定,结果不准,吸 附 法,F,与,B,的,分,离,原理,通过物理涂敷或化学结合方法将抗体结合在不溶性,固相载体上，待抗原与抗体形成结合物,B,后附在固,相物上，游离抗原,F,则留在反应液中。,常用试剂,葡聚糖凝胶，试管，纤维素等。,优点,快速、简便、实用。,缺点,重复性较差,固相本身也可能吸附游离标记药物，结果有误差,固 相 法,F,与,B,的,分,离,原理：,在放射免疫测定系统中，当抗原与抗体,(,第一抗体,),结合反应达到平衡时还不足以生成沉淀而处于“溶解”状态，此时向以上系统中加入,抗,-,抗体,(,第二抗体,),，,则第二抗体与第一抗体特异性地结合，生成复合物沉淀。离心后，与抗体结合的标记药物（,B,）处于沉淀中，而游离的标记抗原于上清液中。,双 抗 体 法,优点,特异性、重现性好，分离效果好,缺点,第二抗体的制备较困难，沉淀时间长,F,与,B,的,分,离,双 抗 体 法,优点,灵敏度高，特异性强，取样量少，适合于大批量样品测定。放射免疫试剂盒的应用。,缺点,1,、准确度和精密度不及色谱法，制备标 准曲线时均采用“双样分析法”，即每个浓度平行测定两次后取平均值。,2,、属非均相免疫分析，操作不能完全自动化,3,、放射性污染,方,法,评,价,放射免疫分析方法评价,第三节 酶免疫分析,（Enzyme Immunoassay,EIA,),常用标记酶,均相酶免疫分析,非均相酶免疫分析,方法评价,常,用,标,记,酶,常用标记酶,酶免疫分析（EIA）以,酶,作为标记物，但酶本身无信号，常通过测定酶与底物（辅酶参与）反应所引起的吸收光谱或颜色深浅等方面的变化以供检测。,试剂盒中,五种试剂：Ag、Ag,、Ab、底物、辅酶,辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、,6磷酸葡萄糖脱氢酶,、半乳糖苷酶、苹果酸脱氢酶,均,相,酶,免,疫,分,析,均相酶免疫分析,酶标记药物与抗体结合后，酶的活性受到抑制或激活，即结合前后酶的活性不同，不需分离，可分别测定。,均,相,酶,免,疫,分,析,酶增强免疫分析,非,均,相,酶,免,疫,分,析,非均相酶免疫分析,酶标记药物与抗体结合后，酶的活性不变，故必须将F和B分离之后，通过其对底物的催化，产生可测信号，进行测定。（常用固相法）,方,法,评,价,优点, 与RIA比，EIA,无放射性,，可避免对人体的放射性 伤害，及对环境的污染。,酶标记物较稳定，,半衰期可超过1年。,不需要温育，,可采用均相免疫方法，,不需将F与B分开。,酶免疫反应产生的信号用普通的可见紫外分光光度计就可测定，,不需昂贵的仪器设备。,缺点,不能直接产生信号，而必须要有其他试剂，,如酶底物、辅酶的参与，才能完成酶反应，引起吸收光谱等变化后方可进行测定。,本章小结,免疫分析基本原理、基本条件和分类,放射免疫分析的原理、常用标记物、,F与 B的分离,均相免疫分析、非均相免疫分析,EIA与RIA的评价,本章掌握内容,免疫分析法的基本原理,放射免疫分析、酶免疫分析、荧光免疫分析名称的英文缩写,均相免疫分析、非均相免疫分析的定义,抗原,-,抗体反应的特点,免疫分析方法必须具备的三种基本试剂,RIA,法和,EIA,常用的标记物,EIA,常用的五种试剂,RIA,法中,F,与,B,的分离方法、原理（,B,与,F,的存在部位）。,
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