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,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,荧光定量,PCR,技术讲座,-,分子生物学实验技术系列讲座,张志坤,2010,、,09,、,10,大纲,一、荧光定量,PCR,技术的基础理论,二、引物及,Taqman,探针的设计,三、内参基因的选择,四、反应体系的优化,五、实验方案的选择,六、误差分析及操作规范,七、实验中污染的防控,八、实验结果的分析,一、荧光定量,PCR,技术的基础理论,1,、荧光定量,PCR,技术概论,荧光定量,PCR,技术产生并成熟于上世纪,90,年代，由于该技,术实现了,PCR,从定性到定量的飞跃，能够对,PCR,反应的全过程进,行实时监控，并且自动化程度高，所以该技术从产生到现在短,短的十几年时间，在科研及检验领域获得了广泛的应用，成为,分子生物学领域不可或缺的一项重要技术。,一、荧光定量,PCR,技术的基础理论,1,、荧光定量,PCR,技术概论,荧光定量,PCR,技术是在,PCR,反应体系中加入荧光基团，利用,荧光信号随着,PCR,反应的积累来实时监控,PCR,反应的进程，并通,过分析软件对,PCR,的反应进行检测分析的技术。,系统组成：定量,PCR,仪、电脑、分析软件、试剂及耗材。,一、荧光定量,PCR,技术的基础理论,2,、荧光定量,PCR,常用的三个概念,扩增曲线、阈值、,CT,值,（,1,）、扩增曲线及扩增曲线的两种形式,左图反映的是随着,PCR,反应的进行相应的荧光信号的变化，比较直观，但是指数期很短；右图反映的是荧光信号的变化量的对数与,PCR,反应循环数的关系，从右图可知，指数期很明显，在确定阈值线时具有简单明了的特点，所以很多软件都采用右图的形式，当然了，这两种实时扩增曲线可以根据实验的需要相互转换。,一、荧光定量,PCR,技术的基础理论,2,、荧光定量,PCR,常用的三个概念,（,2,）、阈值线,在荧光定量,PCR,扩增的指数期，画一条线，在此直线上，,所有样品的荧光强度与其本底荧光强度的差值全部相同。,一、荧光定量,PCR,技术的基础理论,2,、荧光定量,PCR,常用的三个概念,（,3,）、,CT,值,PCR,过程中，各样品扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时，所经过的,扩增循环数。,一、荧光定量,PCR,技术的基础理论,3,、荧光定量,PCR,的化学基础,荧光定量,PCR,是随着,PCR,循环的进行，以荧光信号强度的积,累来实时反映,PCR,反应进程的。理想的荧光物质需具备以下特,点：,（,1,）、本底低,（,2,）、荧光强度高,（,3,）、每轮,PCR,反应完成后都有荧光强度的增高，而且这种荧,光强度的增高和每轮循环后,PCR,产物的量成线性关系,（,4,）、没有,PCR,产物时，没有荧光,（,5,）、该荧光物质的受激发后其发射光的波长范围窄，各种,荧光不会产生荧光的交叉干扰,一、荧光定量,PCR,技术的基础理论,3,、荧光定量,PCR,的化学基础,目前常用的几种荧光物质,（,1,）、,Taqman,探针类,5,端标记荧光基团，,3,端标记淬灭基团，探针完整时，没有荧光，探针断裂后，在激发光的作用下，荧光基团产生荧光；,探针本身序列与目的基因序列互补，特异性高，退火后探针与目的基因互补序列结合，随着,PCR,反应的进行，在,Taq,酶,5-3,外切酶的作用下，探针水解断裂，荧光产生。,一、荧光定量,PCR,技术的基础理论,3,、荧光定量,PCR,的化学基础,Taqman,常用的荧光基团和淬灭基团,荧光基团：,5,端常用荧光基团,FAM,标记，最佳激发光波长：,494-495nm,，最大,发射光波长：,518-520nm,。,淬灭基团：,TAMRA,、,BHQ,、,ECLIPSE,等。,TAMRA,本身也是一种荧光基团，激发光波长范围较宽，,500,560nm,，最佳激发光波长在,560nm,附近，对,FAM,基团产生的发射光,具有较好的吸收作用；其发射光波长较宽，,560650nm,，当做,多重荧光时，容易产生荧光交叉干扰，并且本底较高，故现已,不常用。,BHQ,和,ECLIPSE,为非荧光物质，只是一种荧光淬灭剂，本身不会,产生荧光，光吸收范围较宽，因此本底较低，作为淬灭基团较,为常用，尤其在多重荧光定量,PCR,时常常被采用。,一、荧光定量,PCR,技术的基础理论,3,、荧光定量,PCR,的化学基础,Taqman,探针的特点及应用,（,1,）、特异性强、准确性高,本身具有序列特异性，保证了所检测目的基因的特异,性；其结构特点保证了其所产生的荧光强度与,PCR,产物,的量成正比关系，因此准确性极高。,（,2,）、对引物及试剂要求不高，配套的普通引物就可以使,用，普通的,Taq,酶就能满足实验的要求。,（,3,）、常被用作基因含量的精确检测,(,精确度可达几十个拷贝,),及基因表达变化的精确分析（精确度可达倍的变,化）。,（,4,）、目前价格也不是太贵，左右,一、荧光定量,PCR,技术的基础理论,3,、荧光定量,PCR,的化学基础,（,2,）、荧光染料类,目前常用的荧光染料为,SYBR Green,、,SYBR Green,、,SYTO9,、,HRM,等。其共同性质为：,（,a,）、结合于双链核酸的小沟处,（,b,）、与双链,DNA,结合后受激产生荧光,（,c,）、在变性条件下双链分开，荧光消失,一、荧光定量,PCR,技术的基础理论,3,、荧光定量,PCR,的化学基础,荧光染料的特点及应用,（,1,）、能够与所有的核酸双链结合，受激后产生荧光，其荧光的强度与,双链核酸的含量及长度成正比，因此本底较高；,（,2,）、可做双链核酸的熔解曲线分析；,（,3,）、,SYBR Green,染料本身价格便宜，但是做荧光定量,PCR,时对引物设,计的要求很高；对,Taq,酶要求较高，最好是,HotStar Taq,酶，或者操,作时需要严格的冷启动，冰上操作，否则引物二聚体及非特异性扩,增会严重干扰结果的准确性，尤其是模板含量较低时；,（,4,）、适合于基因含量及基因表达变化的粗略分析或初筛；,（,5,）、在分析的基因种类很多，但是样品量很少时，尤其适用。,（,6,）、对,PCR,反应的毒性，能抑制,PCR,反应，降低,PCR,反应的效率。,一、荧光定量,PCR,技术的基础理论,4,、荧光定量,PCR,的数学原理,对于普通的,PCR,反应来说,n,Xn=X0,（,1,E,）,上式中，,Xn,为,n,轮,PCR,循环后，目的基因,PCR,产物的量；,n,为,PCR,循环数；,X0,为目的基因的初始模板量，,E,为,PCR,的反应效率，,0E1,。,一、荧光定量,PCR,技术的基础理论,4,、荧光定量,PCR,的数学原理,由于,PCR,反应体系中荧光物质的荧光强度与,PCR,产物的量成正比，所以,用荧光强度来代替,PCR,产物的量，我们可以得到：,Rn= RB+ X0(1+ E) Rs,n,总荧光信号强度,=,本底信号,+,分子数量,单位信号强度,Rn,：第,n,个循环时的总信号,RB,：本底,RS,：单位信号强度,X0,：起始,DNA,数目,E,：,PCR,效率,一、荧光定量,PCR,技术的基础理论,4,、荧光定量,PCR,的数学原理,当循环数,n,等于,CT,值时，所有样品荧光信号强度变化量的,对数全部一致，都达到了阈值。,RT= RB+ X0(1+ E) Rs,lg(RT -RB) = lgX0 + CT lg(1+ E) + lg Rs,CT lg(1+ E) = -lgX0 + lg(RT -RB) lg Rs,此时，,PCR,反应处于指数期阶段，所有样品的反应效率,E,稳定且近似相,等；,lg(RT -RB),、,Rs,也都相同，只有,CT,值和,-lgX0,为变量，且这两个变,量之间成一次性方程。,也就是说， 所有样品的,lgX0,与到达阈值时的循环数,n,（,Ct,值）呈线性,关系，根据样品扩增达到域值的循环数即,Ct,值就可计算出样品中所含的模,板量,CT,一、荧光定量,PCR,技术的基础理论,5,、荧光定量,PCR,线性关系成立的条件分析,CT lg(1+ E) = -lgX0 + lg(RT -RB) lg Rs,（,1,）、,PCR,效率相等，在,PCR,扩增的指数期，,E,稳定且为常数；,（,2,）、,RT RB,要相等；也就是说到达阈值时样品的荧光强度与样品的荧,光本底之差要相等；,（,3,）、样品的单位信号强度,Rs,要相等，用荧光染料做荧光基团时，,Rs,就,是每条,PCR,产物结合荧光染料后所发出的荧光强度，此荧光强度和,PCR,产物的长短有关，,PCR,产物越长，结合的荧光染料越多，,Rs,值,越大；用探针做荧光基团时，,Rs,就等于,PCR,反应时，,Taq,酶水解掉,探针，探针的发光基团所发出的荧光强度，和,PCR,产物的长度没有,直接关系。,一、荧光定量,PCR,技术的基础理论,5,、荧光定量,PCR,线性关系成立的条件分析,左图横坐标是,PCR,循环次数，纵坐标是总的荧光强度,Rn,，改图反映的是各个样品随着每轮,PCR,反应，其总的荧光量的实时变化；右图横坐标也是,PCR,循环次数，纵坐标是总的荧光强度与荧光本底的差值,RT RB,即,Rn,的对数，在右图中确定阈值线，该直线上所有样品的,RT RB,的对数都相同，荧光定量,PCR,的线性关系才会成立。,一、荧光定量,PCR,技术的基础理论,5,、荧光定量,PCR,线性关系成立的条件分析,LogX0,与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据未知样品,Ct,值，就可以在标准曲线上计算出未知样品初始模板量。,一、荧光定量,PCR,技术的基础理论,6,、双链核酸的熔解曲线分析,使用荧光染料作为荧光基团时，由于荧光染料的特性随着,PCR,反应的进,行，双链,PCR,产物呈指数增长，,SYBR Green,与双链,PCR,产物结合后荧光越,来越强，当,PCR,反应结束时，荧光强度达到最大，此时对,PCR,产物进行缓慢,加热，从,50,一直加热到,99,，在此过程中,PCR,产物按照,TM,值的大小双链被,依次打开，荧光强度也随着双链的打开依次减弱，如下图：,一、荧光定量,PCR,技术的基础理论,6,、双链核酸的熔解曲线分析,对于核酸序列相同的,PCR,产物，其,TM,值也相同，而且其,TM,值在一个很小,的温度范围内，在此温度区间，其序列相同的核酸双链全部打开，荧光强,度急剧降低，以荧光强度的变化率和温度来作图，则可得到如下图：,一、荧光定量,PCR,技术的基础理论,6,、双链核酸的熔解曲线分析,上图就是熔解曲线，熔解曲线反映的是一定序列长度的核,酸双链，在一定的离子强度下的,TM,值。核酸双链的,TM,值由双链,核苷酸之间相连接的氢键决定，不同的核酸双链，其,TM,值也不,同，所以通过熔解曲线，我们能获知双链核酸的均一性、野生,型和突变型双链之间的碱基差异等，如果采用高分辨率荧光染,料，链条核酸双链哪怕只有一个碱基的差异，通过熔解曲线也,能分析出来。,电泳是通过核酸分子量的大小和构象来分析的，熔解曲线,是根据双链核酸的,TM,值来分析的，这与琼脂糖电泳及,SSCP,有异,曲同工之处。,一、荧光定量,PCR,技术的基础理论,7,、绝对定量和相对定量,一、荧光定量,PCR,技术的基础理论,7,、,mRNA,差异表达的相对定量分析,研究基因表达的情况，我们只需搞清楚该基因在不同生理阶段的变化,趋势如何就行了，而无需知道该基因的绝对量有多少。,实验操作中，由于样品选取时样品的细胞个数不可能完全相同，,RNA,提取,时得率不同、,RNA,反转录为,cDNA,的效率不同等客观因素，用于定量分析的初,始样品浓度不同，这就造成了比较上的混乱，因此在进行基因表达调控研,究中都会用一些看内参基因来标准化，以校正因样品初始浓度不同而造成,的差异。常用的内参基因是在各种生理条件下表达量恒定的基因，这些基,因也常被称为看家基因，该基因表达一般不随外界的变化而变化，所以常,被用作内参照，常用的内参基因有,GAPDH,基因、,-Actin,基因，,18srRNA,基,因等。,一、荧光定量,PCR,技术的基础理论,7,、,mRNA,差异表达的相对定量分析,以上公式就是引入内参基因后相对定量分析的基本公式，并由此派生出两种相对定量的分析方法：双标准曲线法和,Delta-delta Ct,法。,一、荧光定量,PCR,技术的基础理论,7,、,mRNA,差异表达的相对定量分析,（,1,）、双标准曲线法,所谓的双标准曲线法就是对每个样品的内参基因和目的基因都做绝对定量，求出每个样品中内参基因和目的基因的绝对数量，然后根据相对定量的基本公式来求出目的基因的差异表达。,双标准曲线法的特点：,（,a,）、考虑到了不同基因扩增效率的差异，用标准曲线来校正扩增效,率，最大限度的避免了误差；,（,b,）、思路直观、条理清晰、应用简便，操作灵活，无需像,Delta-,delta CT,法那样对实验进行反复的优化；,（,c,）、其不足之处是每次实验都必需对目的基因和看家基因做标准曲,线；,（,d,）、该方法适合样品量大，但是所分析目的基因较少的实验。,一、荧光定量,PCR,技术的基础理论,7,、,mRNA,差异表达的相对定量分析,（,2,）、,2 -CT,法,该方法的前提条件是目的基因和内参基因的扩增效率相同且都为,1,，在试验开始前必须分别对目的基因和内参基因作标准曲线，看两者扩增效率的差别，假如两者扩增效率之间的差异小于，就可以用该方法分析。而且在接下来的实验中，无需再做标准品。,该方法要求严格的重复，因为,CT,值的差异只要有很小的变化，测得的结果就会有很大的差别。,该方法特别适合于样品量不大，但是检测的基因种类很多的情况。,二、引物及,Taqman,探针的设计,1,、染料法引物的设计原则：,（,1,）、序列选取应在基因的保守区段，不能有碱基变异；,（,2,）、避免引物自身或与引物之间形成,4,个或,4,个以上连续配对，避免引物,自身形成环状发卡结构；,（,3,）、检测,mRNA,时，为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显,子；,（,4,）、引物之间的,TM,相差避免超过,2,；,（,5,）、典型的引物,18,到,24,个核苷长；,（,6,）、目的基因和内参基因所扩增的,PCR,产物长度尽量一致，不大于,300bp,，这样有利于使两种基因,PCR,效率相同,（,7,）、将设计好的引物用序列分析软件分析其二级结构并做,BLAST,分析其,特异性,二、引物及,Taqman,探针的设计,2,、,Taqman,探针及引物的设计原则：,在,Taqman,探针法中，,Taq,酶除了,5-3,聚合酶作用之外，还要,5-3,外切酶,的活性来切断探针链产生荧光，普通,PCR,的延伸温度为,72,，此温度为,Taq,酶聚合作用的最佳温度；,Taqman,探针法反应中，在要求,Taq,酶,5-3,聚合酶活,性的同时，还需要,Taq,酶,5-3,外切酶的活性来切断探针链产生荧光，,Taq,酶,5-3,外切酶活性的最佳温度为,60,，所以,Taqman PCR,反应的一般采用两步,法，即,95,变性，,60,复性延伸。,在,Taqman,探针及引物的设计过程中，引物的,TM,值已经确定为,60,左,右，在每轮,PCR,循环的复性过程中（,9560,），为了确保探针先于引物与,模板结合，这就要求探针的,TM,值高于引物,10,左右，所以,Taqman,探针及引,物一般都是引物,TM,值为,60,左右，探针的,TM,值为,70,左右。,二、引物及,Taqman,探针的设计,2,、,Taqman,探针及引物的设计原则：,（,1,）、序列选取应在基因的保守区段，不能有碱基变异；,（,2,）、检测,mRNA,时，为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显,子；,（,3,）、引物,TM,值为,60,左右，探针的,TM,值为,70,左右；,（,4,）、探针的,5,端应避免使用鸟嘌呤,G,，因为,5G,会有淬灭作用，而且即使,是被切割下来还会存在淬灭作用；,（,5,）、整条探针中，碱基,C,的含量要明显高于,G,的含量,G,含量高会降低反应,效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针；,（,6,）、引物之间的,TM,相差避免超过,2,；,（,7,）、典型的引物长度为,18-24bp,，探针长度为,15-45bp,；,（,8,）、,PCR,产物长度在,50-150bp,之间，这样有利于使,PCR,效率相同；,（,9,）、将设计好的引物用序列分析软件分析其二级结构并做,BLAST,分析其,特异性,二、引物及,Taqman,探针的设计,2,、,Taqman,探针及引物的设计原则：,探针中,GC,含量的差异对定量,PCR,反应效率的影响,二、引物及,Taqman,探针的设计,3,、,Taqman,探针及引物的设计举例,1 ATGAACTACG TTGGACAGTT AGCAGGGCAA GTGTTTGTAA CTGTGAAGGA GCTCTATAAG,61 GGACTAAACC CAGCCACGCT GTCGGGATGT ATCGATATAA TTGTTGTACG TCAGCCAGAT,121 GGGAATCTTC AGTGTTCTCC ATTCCATGTA CGCTTTGGGA AAATGGGAGT TCTGCGTTCC,181 AGGGAGAAAG,TGGT,TGAC,AT AGAAATTAAT GGAGAGGCTG TAGATTTGCA CATGAAGCTA,241 GGAGACAATG GAGAAGCCTT TTTCGTCCAG GAGATGGA,TA,ACAATCAGG,A,GGTAATTCCT,301 TATCAT,CTGT,CTACGTCCCC CATCCTGT,CT GAGGGAACTG CGTTAATGGA AGCTCAGCTG,361 AAGAGAAACT CAATTGACAG GATAAGAAAC,CTGGACAGCA GTGTATCTTC,ACAAGTACCA,421 CCCCAAGCTC ATGGATCCCA GCCTGGTACT GAAACATCTC CAGCCTGTAG CTCTGTGAAA,481 AAGAGGAGGA AAAAGAGGAG GAAGTCTACC CACAAAATAG ACAGCTTAAA AAGAGAAGAC,541 ATTGGAGATA CATCAGAAGA TGAAGACATG TTTCCTATAG AGATTAGCTC AGAGGAAGAA,601 AAGGAACAAT TGGACAATTC,AAGG,ATTC,TT GTTCCAGATG TGTTTGTTGA TGAAGTATCT,661 GATATAAAGG CTCCTGCTGT TTCTGCTTAT TCTCAGTCTT CATCTTACCC TCGTTCGGAT,721 GGAGAATGGT CACCCATTCA AAGTAAGCCC ATAGATTACA CAGGGCAATC CTCTCTTCTC,经,Oligo,软件验证，探针,TM,值,70,左右，上下游引物的,TM,值都为,60 ,左右，二级结构,分析，引物和探针比较理想，再经,BLAST,分析，引物和探针特异性较好。,二、引物及,Taqman,探针的设计,4,、,Taqman,探针及引物合成时注意事项,（,1,）、引物及探针设计好之后，委托一家放心的合成公司合成；,（,2,）、先不要急于合成探针，先引物合成，引物合成好以后，做普通,PCR,，电泳检测,PCR,产物，看是否和设计的长度吻合，再看看非特异,性扩增情况，必要时进行,PCR,产物的测序验证；,（,3,）、确定引物没有问题后，再将探针送交合成，这样安排能避免很多以,外的损失；,（,4,）、探针合成好后，先检测一下探针的质量，,250nm,的探针终浓度，,25ul,水，反应体系中只有水和探针，在荧光定量,PCR,仪上检测，,95,，,2min; 95,，,20s,，,60,，,20s,，,40,个,cycles,；看荧光本底和,荧光强度的变化情况，好的探针荧光本底较低，随着,PCR,反应，荧,光强度不会变化，假如荧光强度变化的比较大，说明探针合成质量,较差，建议重新合成。,三、内参基因的选择,1,、理想的内参基因具有的特点,（,1,）、不存在假基因；,（,2,）、高度或中度表达，排除太高或低表达,（,3,）、稳定表达于不同类型的细胞和组织,(,如正常细胞和癌细胞,),，而且其,表达量是近似的，无显著性差别；,（,4,）、表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关；,（,5,）、其稳定的表达水平与目标基因相似；,（,6,）、不受任何内源性或外源性因素的影响，如不受任何实验处理措施的,影响。,理想的内参基因很少或者说不存在，因为所有基因在不同的细胞或组,织中、在细胞的不同生理时期、在不同的理化等外界刺激下，其表达量都,会有所差异，有时可以是几倍、几十倍甚至是上百倍的差异。盲目地使用,一种看家基因作为内参，一方面可能使基因表达的微小差异难以发现，另,一方面可能引致错误甚至相反的结论。,三、内参基因的选择,2,、常用内参基因的表达情况,（,1,）、,GAPDH,GAPDH mRNA,在不同癌组织,(,包括肺癌、乳腺癌、肾细胞癌等,),中的表达,升高，在不同个体间、怀孕期间以及细胞周期的不同阶段等变化很大，在,正常的结肠上皮、人类前列腺癌的细胞周期不同阶段也呈现出显著性变,化。在各种因素,(,例如低氧、胰岛素、地塞米松、丝裂原、表皮生长因子等,),刺激下，培养细胞,GAPDH mRNA,的表达水平也不同。,（,2,）、,-actin,当细胞向恶性转化时，,-actin mRNA,的表达水平增加。,（,3,）、,18srRNA,当细胞有丝分裂时，,18srRNA,表达量显著上调。,三、内参基因的选择,3,、内参基因的选择策略,根据实验的实际情况，不同组织、不同细胞、细胞的不同生理时期、,不同的理化条件刺激等，查阅相关资料，选取三、四合适的内参基因，做,荧光定量,PCR,，先以,CT,值最小的那条基因作为内参，其他几条内参基因与其,相比，分析所得的比值，找出比值稳定的几条基因，比值稳定说明该基因,表达稳定，适合作为理想的内参。,也可用,geNorm,内参分析软件来选择合适的内参基因。,对于比较精确的实验，最好采用两种或两种以上表达稳定的基因作为,内参，对每种内参基因测得的基因表达变化求方差和平均值。,四、反应体系的优化,1,、为什么要优化反应体系,与普通,PCR,反应相比，荧光定量,PCR,在反应中加入了荧光物质，用以实,时显示反应的进程，,Taqman,探针法在普通,PCR,反应体系中加入了与扩增片段,互补的一段带荧光标记的核酸序列，,Taq,酶除了,5-3,聚合酶作用之外，还要,发挥,5-3,外切酶的活性来水解探针链来产生荧光；,SybrGreen,法加入了,能与双链核酸结合的荧光染料，这些荧光物质都能影响,Taq,酶的活性进而影,响,PCR,的反应效率。,普通,PCR,反应体系,模板,引物,Taq,酶,Buffer,Mg2,水,定量,PCR,反应体系,模板,引物,荧光基团,Taq,酶,Buffer,Mg2,水,四、反应体系的优化,1,、为什么要优化反应体系,普通,PCR,结果电泳图,添加荧光基团后,PCR,结果电泳图,四、反应体系的优化,2,、如何优化,由上图可知，添加荧光基团后，,PCR,的反应效率几乎为,0,，所以必须对,荧光定量,PCR,反应体系进行优化，对体系中各个反应成分的浓度进行调整。,其中最关键的因素：,Mg2,浓度、荧光基团浓度、引物浓度,对于,SYBR Green,荧光染料定量,PCR,反应体系来说，,Mg2,的最佳浓度,为；,对于,Taqman,探针反应体系来说，,Mg2,的最佳浓度为左右，引物,最佳浓度为,500nM,，探针的最佳浓度为,250nM,。,四、反应体系的优化,2,、如何优化,SYBR Green,反应体系中,Mg2,浓度梯度优化,PCR,电泳结果,四、反应体系的优化,2,、如何优化,优化后的,Taqman,探针体系实验结果，,Mg2,浓度为左右，引物浓度为,500nM,，探针浓度为,250nM,。,四、反应体系的优化,3,、自行配制荧光定量,PCR,试剂,（,1,）、常用的,SYBR Green,预混酶（,2X,）,HotStar TaqE,Buffer,Mg2,其中,Mg2,浓度为,6,7mM,（,2,）、常用的,Taqman,预混酶（,2X,）,TaqE,Buffer,Mg2,其中,Mg2,浓度为,10mM,五、实验方案的选择,定量,PCR,实验方案,定量,PCR,实验方案,荧光染料法,Taqman,探针法,双标准曲线法,2 -CT,法,双标准曲线法,2 -CT,法,五、实验方案的选择,定量,PCR,实验方案,（,1,）、染料法适合于基因含量及基因表达变化的粗略分析或初筛；在分析,的基因种类很多，但是样品量很少时，尤其适用。,（,2,）、探针法适合常被用作基因含量的精确检测,(,精确度可达几十个拷贝,),及基因表达变化的精确分析（精确度可达倍的变化）。,（,3,）、双标准曲线法适合样品量大、检测的基因种类相对较少、精度要求,较高的实验。,（,4,）、,2 -CT,法适合检测精度要求一般，样品量相对较少，检测的基,因种类相对较多的实验。,根据实验的实际情况，如检测的精度要求、样品数量、基因数量、,经费情况等来选择合适的实验方案。,六、误差分析及操作规范,1,、误差分析,（,1,）、实验方案本身的误差,荧光染料法由于染料本身的特性，不可避免的会引起误差；,2 -CT,法由于也是一种近似的算法，所以不可避免的也会引起,误差；,Taqman,探针法误差相对较小；,双标准曲线法误差相对较小。,（,2,）、仪器设备引起的误差,测量标准品核酸浓度时，分光光度计的误差，从光密度值到质量再,到摩尔量，误差本身就很大（双标准曲线法不一定非要测标准品的,浓度）；,定量,PCR,仪的误差,耗材引起的误差，,96,空板封口膜透光性的差异等,六、误差分析及操作规范,1,、误差分析,（,3,）、相对定量时内参基因表达不稳定引起的误差,（,4,）、操作引起的误差,样品处理、选取、核酸提取、反转录、加样，操作过程中引起的误,差。,2,、操作规范,荧光定量,PCR,是一项对操作要求很高的实验，同时又是花费很高的一项,实验，这就要求必须最大程度的减少误差或避免错误。要想达到这个目,标，我们必须从样品的选取开始到上样检测，每一步都要规范操作。,（,1,）、样品的处理及选取,处理样品时，必须确保样品都得到了充分的处理。如测定一种药物,到小白鼠免疫系统的影响，必须做到每次饲喂时此药品完全被小白,鼠摄食；选取试验样品时，要保证选取的组织尽可能的纯，不要污,染其他组织，如选取脾脏组织时，尽可能的选取脾脏，不能混有结,缔组织等，样品选取好后，即可放入液氮或超低温冰箱保存。,六、误差分析及操作规范,2,、操作规范,（,2,）、核酸提取,加入液氮研磨要彻底，蛋白、多糖、多酚类物质要去除干净，确保,得到高质量的核酸，分光光度计检测核算质量，,RNA OD260/280,左右，,DNA OD260/280,左右，最好再做电泳检测；同一样,品要提取,2,到,3,个,RNA,，所剩余的样品不要丢弃，继续低温保存。,（,3,）、得到的,RNA,立即反转录为,cDNA,，,RNA,样品最好不要存放，反转录所得,cDNA,要用看家基因检测。,（,4,）、对于精度要求较高的定量,PCR,，最好先在样品的所有组织类型内做,内参基因的稳定性分析，找出表达恒定基因作为内参。,（,5,）、做定量,PCR,时，先把除模板外的所有试剂预混，然后分装到,PCR,管,中，分装时尽量采用排枪，加样时尽量最好采用排枪。,（,6,）、体系中最好掺入,ROX,参比荧光，消除光程差和加样的偏差。,六、误差分析及操作规范,2,、操作规范,（,7,）、重复操作,让重复操作最大的修正偏差？最有意义的重复是在提取样品,RNA,时,就重复，同一个样品，分别提取,3,份,RNA,，,3,份,RNA,都做反转录，所,得的,3,份,cDNA,都做定量,PCR,检测，这样的重复之所以最有意义是因,为我们是把,RNA,提取、反转录、上机检测三步做了重复，这样得出,的平均值要比只在上机检测时对同一,cDNA,样品做三个重复要有意义,的多。,同一个,cDNA,样品做三个重复定量检测求平均值主要是消除加样时的,误差，排枪加样时，误差很小，加样时的误差可以通过设几个重复,检测出来。,六、误差分析及操作规范,2,、操作规范,同一,cDNA,样品的三个重复,六、误差分析及操作规范,模板浓度越低，染料法的误差越大。如图一系列梯度稀释的模板，理论上它们,在扩增曲线上的,CT,值之差，应该相等，但是后边几个浓度低的样品,CT,值明显提,前了，由熔解曲线可知对于浓度低的样品，引物二聚体引起的误差非常严重。,七、实验中污染的防控,1,、荧光定量,PCR,实验中污染源的分析,（,1,）、,PCR,产物引起的污染,在检测过程中，荧光定量,PCR,产物都是封闭在,PCR,管中的，不存在开,管检测，所以有污染的话，最有可能是因为电泳检测荧光定量,PCR,产物时引起的污染，只要将电泳室与,PCR,加样室隔离开，就能有效,的避免,PCR,产物的污染。,（,2,）、标准品引起的污染,常用的标准品有含有目的基因的质粒、纯化后的,PCR,产物等，由于,标准品的浓度是一系列从高到低梯度稀释的，所以在稀释过程中，,有可能引起污染。,（,3,）、高浓度的样品引起的污染,高浓度的阳性样品在加样过程中可能会形成气溶胶，造成污染。,七、实验中污染的防控,2,、荧光定量,PCR,实验中污染的防控,（,1,）、对于,PCR,产物引起的污染,最简单有效地办法就是将电泳室与加样室彻底隔离开，做到每个房,间都有专属的移液器，做到移液器专用；或者采用,dU,代替,dT,配合,UNG,酶，是解决,PCR,产物污染的有效办法，但是成本较高。,（,2,）、对于标准品引起的污染,目前只能是以预防，加标准品时最好采用专用移液器，不要和加样,的移液器交叉使用，加标准品时最好在通风厨中进行，和加样的操,作台隔离开。,（,3,）、对于样品间的检查污染,样品间的交叉污染往往是因为高浓度的样品在加样室形成了气溶,胶，因为样品的,cDNA,链较长，经常开紫外灯，把长链,cDNA,打断，能,有效避免此类污染的发生，另外保持加样室空气流通也有助于防止,此类污染。,七、实验中污染的防控,2,、荧光定量,PCR,实验中污染的防控,（,4,）、对于未知污染源的顽固的污染的防控,这类污染也经常出现，找不到明确的污染源，而且此类污染又非常,顽固，对于这种情况，最好的办法就是不去管它，在采用绝对定量,和双标准曲线法时，污染的初始模板量可由阴性对照检测出来，知,道了污染的初始模板量后，我们可以把测得样品的初始模板量减去,污染的初始模板量，在分析时就避免了污染造成的误差。,七、实验中污染的防控,图中最后一个样品为阴性对照，本来应该是一直线，但是仪器也检测到了荧光信号,七、实验中污染的防控,电泳结果显示，该阴性对照确实有,PCR,产物出现,七、实验中污染的防控,通过定量,PCR,检测，测得该阴性样品中含有,227,个初始模板。假如这个污染属于是顽,固的未知污染，可以用正常样品测得的初始模板量减去,227,，来避免污染引起的误差,八、实验结果的分析,实验结束后将得到的结果进行分析，现在很多软件都带有结果的自动分,析功能，可以将结果直接转化为各种图表及柱状图。对于和实验预期偏离,比较大的样品，需重复实验。,谢 谢！,：，QQ ：458261751，都市巡洋舰,如有问题需要交流，请随时联系！,
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