--转录因子

单击此处编辑标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,转录调节因子,还有的蛋白质因子可特异识别、结合自身基因的调节序列,，,调节自身基因的表达，称,顺式作用,。,由某一基因表达产生的蛋白质因子，通过与另一基因的特异的顺式作用元件相互作用，调节其表达。,这种调节作用称为,反式作用,。,c,DNA,a,DNA,反式调节,C,顺式调节,mRNA,C,蛋白质,C,b,A,mRNA,蛋白质,A,A,图,13-3,反式与顺式作用蛋白,指真核生物基因组中含有可以调控自身基因表达活性的特异,DNA,序列。,顺式作用元件能够被特异转录因子识别和结合，从而影响基因表达活性。,顺式作用元件,的作用是参与基因表达的调控，本身不编码任何蛋白质,仅仅提供一个作用位点,要与反式作用因子相互作用而起作用。,1,顺式作用元件（,cis,-acting element),真核生物,顺式作用元件,(,cis,-acting element),可影响自身基因表达活性的,DNA,序列,RNA,聚合酶,B,A,DNA,编码序列,转录起始点,mRNA,RNA,聚合酶,B,A,DNA,转录起始点,mRNA,顺式作用元件,按功能特征，真核基因顺式作用元件分为：,启动子,（,promoter,）、增强子（,enhancer,）、沉默子（,silencer,）,1.1,启动子,真核基因启动子是,RNA,聚合酶结合位点周围的一组转录控制组件，至少包括一个,转录起始点,以及一个以上的,功能组件,。位于转录起点附近，是促进,DNA,转录的,DNA,序列，又称分子内作用元件，是,DNA,分子上可与,RNA,聚合酶结合并使之转录的部位，但启动子本身不被转录。,生物中有许多启动子，如,E.coli,约有,2000,个启动子。各启动子的效率可不相同，,E.coli,的强启动子每,2,秒钟启动一次转录，而弱启动子每,10,分钟才启动一次，从百多个大肠杆菌启动子结构的分析，得知两个强启动子的同源序列的中心在转录起始部位（基因编码链上第一个核苷酸）,5,侧约,10,和,35,个核苷酸处，弱启动子序列中往往有多处核苷酸被置换。,根据启动子的转录模式可将其分为,3,类：组成型启动子、组织或器官特异性启动子和诱导型启动子,.,由两部分组成,：,核心启动子（,CPE),：指保证,RNApol,转录正常起始所必需的、最少的,DNA,序列，包括转录起始位点及转录起始位点上游,-25 -30,bp,的,TATA,盒。它单独起作用时，只能确定转录起始位点并产生基础水平的转录；,上游启动子元件（,UPE),：包括通常位于,-70bp,附近的,CAAT,盒、,GC,盒等，能通过,TFD,复合物调节转录起始的频率，提高转录效率。,并非任何细胞型特异的蛋白在任何情况下都起作用，而是取决于核心启动子提供一个合适的环境来决定基因是被激活还是被抑制。,构建多个启动子连接多个基因的表达载体，虽然可以实现同时转入多个基因的愿望，但这种载体一方面构建困难，另一方面如果引入的启动子之间仅仅有,90bp,的同源性顺序，导入生物体内，就会引起所谓的基因表达,”,共抑制,”,现象，而使基因沉默。因此，将极性启动子人工改造为高效双向表达的启动子，对于促进基因工程的进展具有重要意义。,有研究表明，将单向极性植物表达启动子改造为能够双向表达的启动子对于植物基因工程研究和应用具有不可估量的作用，其应用前景十分广阔。,Promoter elements are defined by mutations and,footprinting,.,用突变法和印迹试验法确定启动子元件,.,在合适的体外或体内检验系统中,启动子是根据其附着序列产生转录的能力来进行定义的,.,通过从一侧逐段缺失来确定启动子的边界,.,当一段缺失不会阻碍,RNA,合成,而下一段缺失使转录不再发生时,那么我们可以确定启动子的边界必然存在于两者之间,.,启动子克隆的几种方法,启动子的克隆对于构建基因工程载体，表达目的蛋白有着重要的意义。启动子克隆的方法很多，从常用的利用启动子探针型载体筛选启动子到,PCR,方法的应用，此后相继问世的一些基于,PCR,法的克隆启动子技术，像,I-PCR,、,P-PCR,、,SSP,PCR,、,YADE,、,TAIL-PCR,等，为克隆启动子提供了更可靠，更合理的方法。,利用启动子探针载体筛选启动子,利用启动子探针载体筛选启动子的过程为，先选用,1,种适当的限制性核酸内切酶消化切割染色体,DNA,，然后将切割产生的,DNA,限制片段群体与无启动子的探针质粒载体重组，并按照设计的要求使克隆的片段恰好插在紧邻报告基因的上游位置；随后再把重组混合物转化给寄主细胞，构建质粒载体基因文库，并检测报告基因的表达活性。,利用,PCR,技术克隆启动子,即根据发表的基因序列，设计引物，克隆基因的启动子，由于,PCR,法简便快捷，近年来人们较多采用此方法克隆基因启动子。,苏宁等根据已报道的水稻叶绿体,16SrRNA,启动子基因序列设计,5,启动子序列的引物，以水稻叶绿体,DNA,为模板，,PCR,扩增出,16SrRNA,基因,5,启动子区的片段，酶切克隆到,pSK,的,SacI,和,SphI,位点，构建测序载体质粒,pZ16S,，进行序列测定，结果表明所克隆的片段长为,144bp,，含有,SD,序列。同源比较结果表明，所克隆的片段与水稻叶绿体,16SrRNA,启动子序列具有,100,的同源性。,环状,PCR,环状,PCR,包括,I-,PCR(Inverse,-PCR),和,P-,PCR(Panhandle,-PCR),。这,2,种,PCR,都是根据一端已知序列设计的嵌套式引物进行,PCR,。,I-PCR,的实验程序包括，基因组,DNA,经酶切后用,T4DNA,连接酶进行自连接，产生环状,DNA,片段；以环化产物为底物，用根据已知片段设计的反向引物进行,PCR,扩增，从而得到含有未知片段的扩增产物,P-PCR,是由,Jones,等提出的利用末端反向重复序列与已知序列互补配对形成环状单链模板，有效增强了引物与模板结合的特异性。反应需要,3,个根据已知序列设计的引物，,3,个引物在已知序列内呈线性排列，其中第,3,个引物可作为接头使用，可与已知序列互补配对形成锅柄状单链模板。其过程为，首先酶切基因组,DNA,，产生,5,或,3,粘末端，然后连接上合适的接头,(primer 3),，连接好后最好用核酸外切酶,I,除去多余的接头，由于连接上的接头与已知序列是反向重复序列，变性后的,DNA,单链可退火形成锅柄状单链模板，之后分别用,3,个单引物进行,3,次,PCR,扩增，能有效地扩增,2,9kbp,的大片段未知序列,。,利用载体或接头的染色体步行技术克隆基因启动子,这类方法的第一步都是酶切基因组,DNA,，连接载体或接头，既可以用,pUCl8,等质粒载体，也可以使用,DNA,等噬菌体载体，只要选用的载体带有合适的酶切位点；同样根据实验需要，接头既可以是双链也可以是单链，然后根据基因组,DNA,序列设计的特异引物和载体的通用引物或接头序列进行扩增。,TAlL,-PCR,很早就有用随机引物的,PCR,，但由于无法有效地控制由随机引物引发的非特异产物的产生，所以一直未能广泛应用。近年来由,IJiu,等设计的,TAIL-,PCR(Termal,Asymmetric Interlaced PCR),又叫热不对称交错,PCR,，则解决了这个问题，后来有研究表明，经改良过的,TAIL-PCR,成功地从突变体中克隆到外源插入基因的旁侧序列，从而为启动子的克隆提供了有效的新方法。,TAIL-PCR,的基本原理是利用目标序列旁的已知序列设计,3,个嵌套的特异性引物,(,specialprimer,，简称,sp1,，,sp2,，,sp3,，约,20bp),，用它们分别和,1,个具有低,Tm,值的短的随机简并引物,(,Arbitrarydegenerate,prime,，,AD,，约,14bp),相组合，以基因组,DNA,为模板根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环，通过分级反应来扩增特异引物,。,与启动子功能变异有关的疾病,以下是从人类孟德尔 遗传学（,OMIM,）证实与启动子故障有关，不论是因启动子序列直接突变或是转录因子或转录共激发因子的突变：哮喘，,地中海贫血， 鲁宾斯坦泰比综合症等。,启动子的优化,关于启动子的优化，可将所有的影响因素和其水平列一个表，选择合适的正交表去做,。另外,关键的几个区域如,TATA Box,等是不能动的，然后看增强子等顺式元件及阻遏,/,诱导蛋白接合区域的情况，进行缺失突变和置换突变，等等。,1.2,增强子,(enhancer),指远离转录起始点、决定基因的时间、空间特异性、增强启动子转录活性的,DNA,序列。,特点：,（,1,）它能通过启动子大幅度地增加同一条,DNA,链上靶基因转录的频率，一般能增加,10,200,倍，有的甚至可达千倍。,（,2,）增强子的作用对同源或异源的基因同样有效，如把,SV40,的增强子连接到兔,-,珠蛋白的基因上，可使转录强度增大,100,倍；,（,3,）增强子的位置可在基因,5,上游、基因内或其,3,下游的序列中，增强效益与其位置和取向无关；,（,4,）增强子所含核苷酸序列大多为重复序列，其内部含有的核心序列，对于它进入到另一宿主之后重新产生增强子效应至关重要；,（,5,）增强子一般都具有组织和细胞特异性；,（,6,）增强子在,DNA,双链中没有,5,与,3,固定的方向性；,（,7,）增强子可远离转录起始点，通常在,1,4 kb,（个别情况可达,30 kb,）外起作用；,（,8,）增强子的活性与其在,DNA,双螺旋结构中的空间方向性有关。另外，许多增强子还受到外部信号的调控，如金属硫蛋白基因的增强子就可对环境中的锌、镉浓度作出反应。,从机能上讲，没有增强子存在，启动子通常不能表现活性；没有启动子时，增强子也无法发挥作用。,有时，对结构密切联系而无法区分的启动子、增强子样结构统称启动子。,通常描述的、具有独立的转录活性和决定基因时间、空间特异性表达能力的启动子就是这类定义的启动子。,1.3,沉默子,(silencer),又称衰减子（,attenuator,），弱化子，某些基因的负性调节元件，当其结合特异蛋白因子时，对基因转录起阻遏作用。,它本身不能实现衰减作用，必须通过对前导序列的翻译才能实现，衰减作用的实质是以翻译手段控制基因的转录。,2,反式作用因子,（,trans-acting factor,）,指能直接或间接识别和结合在顺式作用元件上，调控靶基因表达的蛋白质因子，也称为转录因子（,transcriptional factor,，,TF,）。,所有细胞中的,DNA,都是一样的，但基因调控保证了每种细胞的特异性蛋白质会在正确的时间出现在正确的地点，控制这个过程的蛋白质就是转录因子。,蛋白质,-DNA,，,蛋白质,-,蛋白质相互作用（,interaction,）,是其发挥功能的基础。,基本转录因子（非特异转录因子）,参与转录,调控的因子 转录调节因子 转录激活因子,（,DNA-,蛋白质） 转录抑制因子,共调节因子,（蛋白质,-,蛋白质）,特点：,至少含,3,个功能结构域,：,DNA,结合功能域，转录活性功能域，其他转录 因子结合功能域；,能识别并结合上游调控区中的顺式作用元件；,对基因表达有正性或负性调控作用，即激活或阻遏基因表达。,目前研究较广泛的有,:,识别,TATA,区的,TF,D,，识别,CAAT,区的,CTF,，识别,GGGCGG,的,SP1,，识别热激蛋白启动区的,HSF,。,2.1,按功能特性分为：,2.1.1,基本转录因子,(general transcription factors),是,RNA,聚合酶结合启动子所必需的一组蛋白因子，决定三种,RNA,(m,RNA,、,tRNA,及,rRNA,),转录的,类别，,包括,TF,A、TF,B、TF,D、TF,E、TF,F、TF,H、TF,I,等7种因子。,。,真核,RNA,聚合酶,在转录因子帮助下，形成转录起始复合物。,Pol,TFH,TAF,TFF,TAF,TAF,TFA,TFB,TBP,DNA,TATA,EBP,TBP,2.1.2,转录调节因子,(special transcription factors),与增强子或各类应答元件等顺式元件结合，具有,调节转录活性的一类功能蛋白。,种类繁多，功能复杂，是细胞内信号转导系统的靶分子。,为个别基因转录所必需，决定该基因的时间、空间特异性表达，如调控免疫球蛋白表达的核内蛋白质因子（,NF,）。,转录激活因子,：起转录激活作用，通常是一些增强子结合蛋白质。,转录抑制因子,：起转录抑制作用，多数是沉默子结合蛋白质。,转录调节因子结构,DNA,结合域（锌指结构）,转录激活域,TF,蛋白质,-,蛋白质结合域,（二聚化结构域）,具有锌指结构的转录因子，如核受体家族；,具有碱性,DNA,结合域的转录因子超家族，如碱性亮氨酸拉链（,bZIP,）,转录因子，,AP-1,，,ATF/CREB,等,;,具有螺旋,-,转角,-,螺旋（,HTH,）,结构的转录因子；,其他：如,NF-,B,家族、,STAT,家族、,P53,家族等。,许多转录因子以同二聚体和异二聚体的形式发挥作用，所以它们据此可进一步细分成亚家族。正是由于许多转录因子能异二聚体化，从而极大地增加了转录调节的多样性和特异性。,2.2,按,DNA,结合域的结构分为：,2.2.1,锌指,(zinc finger),锌指结构：,DNA,结合域中含较多的半胱氨酸和组氨酸的区域借肽链弯曲使,2,个组氨酸与,2,或,4,个半胱氨酸与,1,个锌络合成的指状结构。,具有锌指结构的反式因子都含有几个相同的指结构，其指尖部插入,DNA,双螺旋深、浅沟中，调控相应基因，羧端无指，功能是与,RNApol,或其他转录因子结合。,常结合,GC,盒,C ,Cys,H His,C,2,H,2,型锌指（,Zinc finger,）,Zn,Cys,His,2.2.2,亮氨酸拉链（,leucine,zipper,，,bZIP,）,亮氨酸拉链：是,DNA,结合域中约,30,个氨基酸组成的核心序列，,N,段富含碱性氨基酸，形成,DNA,结合面，另一侧每隔,6,个氨基酸残基出现,1,个亮氨酸残基，称亮氨酸拉链区，两个具有亮氨酸拉链区的反式作用以疏水作用形成亮氨酸拉链。,亮氨酸拉链的空间构象使反式因子碱性区域处于能与,DNA,结合的空间位置，是蛋白质二聚体化,(,蛋白质相互作用的一种方式,),的一种结构基础。蛋白质通过亮氨酸拉链形成二聚体，大大增加对,DNA,的结合能力，调控基因表达。,2.2.3,螺旋,-,转角,-,螺旋（,helix-turn-helix,）,有至少两个,-,螺旋区，中间有短侧链氨基酸残基形成转折，同源域蛋白通过其第三个螺旋与双链,DNA,的大沟相结合，其,N,端的多余臂部分则与,DNA,小沟结合，提高了稳定性。,2.2.4,螺旋,-,环,-,螺旋（,helix-loop-helix,，,HLH,）结构,是含,100-200,个氨基酸残基的肽段；有,2,个,-,螺旋区，附近有,1,段富含碱性氨基酸区组成。螺旋区是形成二聚体必须的，碱性氨基酸区是结合,DNA,必需的。,HLH,类蛋白只有形成同源,/,异源二聚体时，才具有足够的,DNA,结合能力。,2.3,共调节因子,(co-regulators),或辅因子,位于细胞核内，通常不直接与,DNA,结合，但能与转录因子作用，可在通用转录因子和转录调节因子间起架桥作用，并可改变局部染色质的构象，促进基因的转录。,根据共调节因子对转录激活作用的影响，可分为共激活因子和共抑制因子两大类：,共激活因子,(co-activators,，,CoA,),具有组蛋白乙酰化酶,(,histone,acetyltransferase, HAT),的活性或能与,HAT,结合，,HAT,能使组蛋白乙酰化，导致缠绕核小体的,DNA,解旋，,DNA,模板裸露，使,TF,容易与,DNA,结合，从而促进转录。,共抑制因子,(co-repressors),能与组蛋白脱乙酰化酶,(,histone,deacetylase, HDCA),结合,通过后者使组蛋白去乙酰化，从而抑制基因转录。,2.4,转录调节因子的作用方式,通过二聚化、多聚化、磷酸化激活,与顺式元件结合,与基本转录因子相互作用,与,DNA,结合后，转录因子须进一步与基本转录因子发生相互作用才能表现转录调节活性,辅助因子的参与,线粒体转录因子,A,的研究进展,线粒体转录因子,A(mitochondrial,transcription factor A,，,TFAM),是参与线粒体,DNA,转录激活和调节线粒体,DNA,拷贝数的重要因子。,TFAM,由核基因编码，并被转入线粒体内发挥调节作用。除了转录激活作用外，,TFAM,还参与维持线粒体,DNA(mitochondrial,DNA,，,mtDNA,),的拷贝数，改善线粒体功能以及调控肌浆网钙,ATP,酶表达等。,转录调节因子的作用机制,3.,常见转录调节因子及其功能,cAMP,应答元件结合蛋白,CREB,激活蛋白-1,(,activator protein-1,AP-1),信号转导和转录激活因子,STAT,核因子-,B(NF,-,B,),3.1 CREB,家族,家族成员有,CREB、ATF1、CREM,二聚化形成亮氨酸拉链与,DNA,结合，调节特定基因的表达,是,cAMP,和钙调蛋白信号转导途径的最终靶分子,结合的顺式元件序列一般为,5-,TGACGTCA-3，,称为,cAMP,应答元件,(CRE),，主要,存在于基因的启动子与增强,子上 。,cAMP,激活,PKA,后，可解离出,2,分子催化亚单位，使,CREB,第,133,位的丝氨酸残基磷酸化；胞外,Ca2+,内流或从细胞内贮存库释放,Ca2+,时，也引起,CREB,第,133,位的丝氨酸残基磷酸化磷酸化的,CREB,与,CRE,回文序列结合，调控基因的表达。,CREB,3.2 AP-1(Fos/Jun),AP-1,是即早基因家族,c-fos,和,c-jun,的蛋白产物,Fos,和,Jun,结合成的异源二聚体，或,Jun,的同源二聚体，前者活性高于后者,AP-1,顺式元件序列为,TGACTCA，,以亮氨酸拉链与,DNA,结合，引起细胞增生、分化等效应,AP-1,继,cAMP,和,Ca,2+,后，起信号转导的中介作用，因此也被称为,第三信使,AP-1,二聚体也是亲电子应答元件,EPRE,的识别因子，,O,2,、H,2,O,2,的形成可同时激活,NF-B,和,AP-1，,诱导胶原酶和金属硫蛋白的表达,3.3 STAT,家族,Signal transducers and activators of transcription,STAT,家族包括,STAT16，,氨基酸数目为,734851，,主要差别在,C,末端,。,STAT,分子含有几个高度保守的功能区,STAT,二聚体形成亮氨酸拉链与,DNA,结合,STAT,对机体免疫反应的调节起重要作用,可被,IFN、,生长因子,、,血管紧张素,、,IL-6、IL-10,等活化,可被,IFN,、IFN,活化,诱导各种急性相的应答基因表达,被,IL-2,活化,，,促进,Th1,细胞分化,被,IL-4,活化,，,介导,MHC-,抗原,、,各类,Ig,类受体及其他细胞表面蛋白质的向上调节,IL,是由多种细胞产生并作用于多种细胞的一类细胞因子。由于最初是由白细胞产生又在白细胞间发挥作用，所以由此得名 。,STAT,家族的活化,细胞因子及催乳素与其受体结合，激活,受体偶联型酪氨酸蛋白激酶,JAK,家族成员，后者使,STAT,分子中的,Tyr,残基磷酸化，进而形成活化的二聚体，穿过核膜结合到特定,DNA,序列上调节基因表达。称为,JAK-STAT,途径,生长因子的跨膜受体具有酪氨酸蛋白激酶活性，与相应生长因子结合后，可直接使,STAT,磷酸化,血管紧张素受体与,G,蛋白偶联，可能通过,G,蛋白使,STAT,磷酸化,JAK-STAT,途径,JAK,即,Janus,Kinase,(,两面神激酶,),是一种非受体型酪氨酸蛋白激酶,(PTK),。,该族成员有,7,个同源区,(JH1-7),其中,JH1,区为激酶区,JH2,区为伪激酶区。与其它,PTK,不同,JAK,内无,Src,同源区,2(SH2),结构,因其既能催化与之相连的细胞因子受体发生酪氨酸磷酸化,又能磷酸化多种含特定,SH2,区的信号分子从而使其激活,故称之为,Janus-,罗马神话中前后各有一张脸的门神。,STAT,即,Signal transducers and activators of transcription(,信号传导及转录激活因子,),含有,SH2,和,SH3,结构域,可与特定的含磷酸化酪氨酸的肽段结合。当,STAT,被磷酸化后,发生聚合成为活化的转录激活因子形式,进入胞核内与靶基因结合,促进其转录。,该途径的基本作用模式,配体诱发相应受体形成二聚体或寡聚体，引起与受体结合的,JAK,相互作用，发生自身酪氨酸磷酸化而激活；同时催化受体发生酪氨酸磷酸化,继而以这些磷酸化的酪氨酸为“锚点,”,，招引多种含特定,SH2,区的信号分子，并将其活化，通过这些分子的作用使胞外信号传入胞核内。,MAPK,与,JAK-STAT,途径,MAPK,即丝裂原激活的蛋白激酶,(,Mitogen,activated protein,kinase,),是,Ras,途径中的下游信号分子,具有丝氨酸,/,苏氨酸蛋白激酶活性,可激活,C-,Fos,、,C-Jun,等转录调节因子,形成,AP-1,作用于核内,激活特定的基因从而传递信号。,MAPK,的激活需要其分子中特定的,Tyr,残基和,Ser,残基同时被磷酸化,。以前认为,Ras,途径与,JAK,途径虽共存于细胞因子的信号传导中,但互相独立。,最近发现,MAPK,可能处于调节这两条途径的关键位置。,JAK,的激活伴有,MAPK,的活化,但仅有,JAK,激活不足以使,STAT,最大程度地发挥其转录激活活性。,Stat3,在传导信号时不仅发生了,Tyr,残基磷酸化,同时还有,Ser,残基磷酸化,且磷酸化的,Ser,残基为与,DNA,上的调节区结合所必需；,STAT,蛋白上存在可被,MAPK,识别且磷酸化的特异性序列。,与,Stat3,类似,Stat1,也必需有,Ser,残基磷酸化才能完全活化。,非受体型酪氨酸蛋白激酶,(PTK),。,SH-PTP1,的负反馈调节作用,SH-PTP1,即含,SH2,区的酪氨酸磷酸酶,(PTPase1),。,PTPase,分为跨膜型与非跨膜型两种,SH-PTP1,和,2,都属于后者。,SH-PTP2,参与受体型,PTK,介导的信号传递,可看作是一种正的信号传递分子；,SH-PTP1,则主要对,PTK,介导的信号传递起抑制作用。,已知,IL-3,和,EPO,都主要通过,JAK2,传导信号。,EPOR,上第,429,位酪氨酸在,EPO,作用后被,JAK,磷酸化,从而具备了结合,SH-PTP1,并使之活化的能力。这一作用的特异性取决于该残基周围特定的氨基酸序列,即,PY-,Leu-Tyr-Leu-Val-Val,含有这段序列的,11,肽即足以结合并活化,SH-PTP1,。,EPOR,上此种酪氨酸的缺失可使细胞对,EPO,的敏感性升高,5,到,10,倍。,IFN-,作用后,IFN-,受体可与,SH-PTP1,可逆性结合。同样，接受这种刺激的,Moptheaten,小鼠巨噬细胞中,JAK1,和,Stat1,酪氨酸磷酸化水平明显高于正常,而对,型,IFN,信号传导同样重要的,TYK2,Stat2,活化水平则无明显变化。,JAK,和,STAT,的功能,STATs,调节的基因范围很广,IFN,调控基因的表达需要,Stat1,和,2,；,IL-6,诱导的急性期反应基因的表达需要,Stat3,；,Stat5,介导催乳素诱导的多种基因表达；,Stat6,为,IL-4,诱导的免疫球蛋白类别转换和,MHC,类抗原与免疫球蛋白受体等的上调所必需。,JAK,能直接或间接磷酸化,Vav,PLC-1,等其它信号分子,从而激活其它信号传导通路。,IL-4,诱导的胰岛素受体底物,(IRS)1,、,2,的磷酸化也需,JAK,的活化。,JAK,和,STAT,除了共同构成,JAK-STAT,途径传导信号外,各有其相对独立的作用。,NF-,B,为一个转录因子蛋白家族，包括,5,个亚单位：,Rel,(,cRel,),、,p65 (,RelA, NF-B3),、,RelB,和,p50(NF-B1),、,p52(NF-B2),。,p65,、,cRel,和,RelB,含有,N,端,Rel,同源区,(,Rel,homology domain, RHD),和,C,端的反式激活结构域（,transactivation,domain, TD,），在,RHD,的,C,末端有一个核定位区域,(nuclear-localization sequence, NLS),，负责与,DNA,结合、二聚体化和和核易位，而,TD,则与转录活化相关。,p50,和,p52,只有,RHD,而缺乏,TD,，因此，,p50,和,p52,同源二聚体并不能激活基因转录，而是作为一种抑制分子存在，它们在细胞内通常各自以其前体,p105,和,p100,的形式存在。两个亚基形成的同源和,/,或异源二聚体与靶基因上特定的序列（,-,B,位点）结合调节基因转录，不同的,NF-,B,二聚体在选择结合序列时可能略有差异，这是,NF-,B,通过不同的二聚体的形式对不同基因的表达进行精细调节的一种方式。,3.4 NF-,B,家族,最常见的,NF-,B,二聚体是,p65,与,p50,组成的异二聚体。,NF-,B,的抑制单位,IB,通过其,C,末端特定的锚蛋白重复序列,(,ankyrin,repeat motif),与,NF-,B,结合，并覆盖,NLS,阻止,NF-,B,向细胞核内转移。,在静息的细胞中，,NF-,B,和,IB,形成复合体，以无活性形式存在于胞浆中。当细胞受细胞外信号刺激后，,IB,激酶复合体（,IB,kinase, IKK,）活化将,IB,磷酸化，使,NF-,B,暴露核定位位点。游离的,NF-,B,迅速移位到细胞核，与特异性,B,序列结合，诱导相关基因转录。,I-,B,解离机制的几种假说,蛋白磷酸化，要活化,NF- B， I- B,必须发生蛋白酶解，故需要蛋白激酶和蛋白磷酸酶参与,活性氧,的作用，特别是过氧化物在,NF- B,活化中起一定作用，其机制可能是通过信号转导，间接作用于胞质的,NF- B,/,I- B,复合体,遍在蛋白,的作用，,I- B,和,p105,磷酸化后被遍在蛋白缀合酶识别，使,I- B,和,p105,遍在蛋白化，经蛋白酶小体降解加工，,I- B,降解，释放出,p105-p65,蛋白复合体，经加工后生成有活性的,NF- B,NF- B,已存在于细胞质，不需要新合成,与,I- B,简单的解离反应就可触发激活,NF- B,主动参与胞质胞核信号转导,NF-,B,受外界刺激因素活化后，可迅速诱导基因表达，这是因为,参与免疫反应的早期和炎症反应各阶段的许多分子都受,NF-,B,的调控，包括：,TNF-,、,IL-1,、,IL-2,、,IL-6,、,IL-8,、,IL-12,、,iNOS,、,COX2,、趋化因子、粘附分子、集落刺激因子等。此外，锌指蛋白,A20,、血红素加氧酶,-1 (HO-1),等一些抗炎和与细胞凋亡有关的分子如：肿瘤坏死因子受体相关因子,-1,（,tumour,-necrosis factor receptor associated factor -1,，,TRAF-1,），抗细胞凋亡的蛋白,-1,和,-2,（,inhibitor of apoptosis 1/2 , IAP1/ IAP2,），,TNF,受体相关因子（,receptor,associated factors,，,TRAF1 /TRAF2,），,Bcl-2,同源体,A1/Bfl-1,和,IEX-IL,也都受,NF-,B,的调控,。,4.,基因转录受细胞外信号的调节,细胞内外刺激能通过细胞信号转导通路改变转录因子和辅因子的表达或活性来调节靶基因的表达,状态，以适应环境，维持稳态和生长和发育的需要。,3.1,磷酸化调节,膜受体信号转导通路通过激活的蛋白激酶或磷酸酶对转录因子进行的可逆的磷酸化修饰，调节它们的活性和功能。,包括：,促进胞浆转录因子核转位,如,STAT,( signal transducer and activator of transcription),和,NF-,B,的激活和核转位；,增强转录因子，如,AP-1,、,P53,等与,DNA,的结合能力；,提高转录因子,，如,cAMP,反应元件结合蛋白,(,CREB,),的转录活性。,STAT,STAT,JAK,JAK,Y,Y,P,P,P,P,P,P,细胞因子,STAT,STAT,P,P,核转位,与,DNA,结合,诱导转录,细胞表型改变,细胞因子应答元件,酪氨酸磷酸化,TNF,与受体结合,激活,IKK,激活转录因子,NF-,B,促炎细胞因子,(TNF, IL-1,等,）,磷酸化,I,B,NF-,B,配体调节的转录因子 ：,如核受体家族成员,核内受体类,脂溶性激素穿过细胞膜，在细胞质内或核内与相应受体结合，激素-受体复合物与,DNA,结合发挥转录调节作用。,包括糖皮质激素受体（,GR）、,盐皮质激素受体,(MR）、,甲状腺素受体（,TNR）,等。,不需经繁杂的信号转导过程，激活的受体可直接进入核内， 以锌指结构与靶序列结合。,核受体的病理生理,核受体作为一类配体依赖性的,转录调节因子,，能通过调节基因表达，调控有机体的生殖、生长发育和代谢，参与免疫、炎症反应和药物代谢，在维持机体的稳态中发挥重要作用。已证实它们参与了多种疾病，如雌激素依赖性乳腺癌、雄激素依赖性的前列腺癌的发生与发展。,转录因子活性的检测,