生物技术综合实验

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,动物血中超氧化物歧化酶（,SOD,）的提取、分离纯化及含量、活性、相对分子质量的测定,生物技术综合实验（二）（,P40-70,）,授课老师：马 超 韦明肯,授课对象：生物技术,12-1,班，生物技术,12-2,班,理论内容部分,一、超氧化物歧化酶,简称,：,SOD,.是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在,新陈代谢过程中产,生的有害物质。对人,体不断地补充SOD,具有抗衰老的特殊,效果。,它们以铜,和锌、或锰、铁、,或镍作为辅因子,超氧化物歧化酶的来源,超氧化物歧化酶的来源有很多途径，可以根据当地的原料来源，成本需求，技术要求来选取不同的提取途径。,其中根据不同的分类有以下几个途径获取该酶。,1、植物提取,2、动物提取,3、微生物的生产发酵,4、人工合成,发展历史,超氧化物歧化酶（,Superoxide Dismutase, EC1.15.1.1, SOD,）是,1938,年,Marn,等人首次从牛红血球中分离得到超氧化物歧化酶开始算起，人们对,SOD,的研究己有七十多年的历史。,1969,年,McCord,等重新发现这种蛋白，并且发现了它们的生物活性，弄清了它催化过氧阴离子发生歧化反应的性质，所以正式将其命名为超氧化物歧化酶。,超氧化物歧化酶的作用机理,氧气在有机体内代谢还原，提供了生物能量，最后生成水，共接受,4,个电子。在这还原过程中，每接受一个电子就生成一个氧自由基或活性氧。但氧自由基，能引起细胞损伤，导致疾病发生。,O,2,+eO,2,O,2,+2e+2H+ H,2,O,2,O,2,+3e+3H+ H,2,O+OH,O,2,+4e+4H+ 2H,2,O,而,SOD,是体内专一清除超氧阴离子自由基的一个抗氧化酶。,SOD,的催化过程如下：,O,2,-,+O,2,-,+2H,+,H,2,O,2,+ O,2,SOD,将,O,2,-,歧化生成双氧水。国内外对,SOD,的毒性进行了广泛的研究，大量资料表明,SOD,无毒、无副作用。,二、SOD用途及前景,1、抗氧化,2、抗衰老,3、预防慢性病及其并发症,4、抗疲劳,5、化疗副作用的消除剂,6、避免手术的二次伤害,手术会引起大量自由基，故建议手术前后口服抗氧化剂来迅速恢复体力加速伤口复原。,超氧化物歧化酶的应用,健康上的应用,SOD是人体内最主要的抗氧化物质，是氧自由基的克星和专一清除剂；它清除人体内一些自由基。它保护细胞对抗毒性，调节H,2,O,2,的浓度，对付微生物的侵害，并且增强抗氧化酶的活性，迅速清除过剩的自由基，保持身体健康，体力充沛，面容体态年轻。全球118位科学家发表联合声明：自由基是百病之源，SOD是健康之本。体内的SOD活性越高，寿命就越长。,药物类,主要集中在炎症病患者，尤其治疗类风湿关节炎、慢性多发性关节炎、心肌梗塞、心血管病、肿瘤患者以及放射性治疗炎症病患者；,用于生化制药,作为一种生化酶制剂，广泛应用于临床和科研上，具有极强的抗衰老，抗肿瘤、 调节人体内分泌系统作用；,用于化妆品类,可添加在化妆品中，具有抗氧化抗腐蚀的优良性能。,有减少皱纹、祛斑的功效以,SOD,为主要成份的产品风靡世界，引发了化 妆品历史上的一场革命，使人类永葆青春美丽梦想成真；,用作保健食品、饮料,如,SOD,糖、,SOD,口服液、,SOD,干啤等都非常畅销,!,在饮料、糖果、糕点等食品中加入,SOD,既可利用其抗腐蚀性延长保质期，又可调节人体内分泌系统,总之，超氧化物歧化酶可以清除体内过量的自由基，提高人体免疫力，延缓衰老；有效降低血脂、胆固醇、血压； 抗疲劳，增强肝肾功能；抗辐射；对糖尿病有明显的恢复作用；调节女性生理周期，推迟更年期 。,应用前景,SOD 是一种新型的抗炎症药,尤其对关节炎和类风湿关节炎有明显疗效,根据SOD 作用机制和毒性试验,它对治疗因O,2,引起的各种疾病都有一定的疗效,。,为此,SOD 可作为抗衰老、抗炎症、自身免疫疾病患者广泛应用的医药品。此外,SOD 对治疗贝切特氏症、心肌梗塞等血虚性心脏病、胶原病、新生儿呼吸困难综合症、防御放射性伤害等也可望有效。近年来美,、日、德、英国等对,SOD 作为药品开发应用进行了一系列研究和临床试验并得到广泛应用。,可以预言,随着人们对,SOD,更广泛深入的研究,不同类型,SOD,、,SOD,修饰物及人工有机合成,SOD,模拟酶将在医疗、保健、食品、农业增产等方面发挥出更大的作用,.,三、,SOD,提取方法,实验部分,(P40-70,）,一、基本内容：,细胞破碎及酶的抽提。,两种蛋白质含量测定方法及酶的活力测定。；,离子交换柱分离操作及分析。,SDS-PAGE,电泳测定蛋白质分子量。,固定化酶的制备技术。,6.,酶的柱层析分离操作，包括装柱，恒流泵及部分收集器的试调，上样，洗脱等。,7,.,IEF,测蛋白质,PI,；,8,.,POD,同工酶分析；,9.,细胞器的分离及其标志物（酶）的测定,二,.,目的要求,学习提取分离纯化超氧化物歧化酶的方法，掌握酶分离纯化的基本操作技术。包括以下内容：,1,细胞破碎及酶的抽提；,2,酶的柱层析分离操作；,3,酶的活力测定。,三,.,基本原理,超氧化物歧化酶,(,superoxide,dismutase, SOD, EC 1.15.1.1),是一,种歧化超氧负离子自由基,O,2,生成,H,2,O,2,和,O,2,的金属蛋白，为胞内酶，,在生物体内具有延缓机体衰老，对肿瘤,、,自身免疫性疾病和辐射损伤具有重要的防御作用，是一种重要的药用酶。根据所含的金属离子，,SOD,可分为三类：,Cu,、,Zn,SOD,、,Mn,SOD,和,Fe,SOD,。,SOD,在生物界中分布极广，原核生物和真核生物中都有存在。,本实验从血中提取,SOD,，提取液经葡聚糖凝胶柱上层析，分离出,SOD,，然后用邻苯三酚法测定其酶活力。邻苯三酚在自氧化过程中产生有色中间物,（红桔酚）,和,O,2,-,使溶液颜色变褐加深。加入,SOD,能歧化,O,2,-,阻止中间物,（红桔酚）,的积累，通过分光光度计比色分析反应液的颜色而测定其酶活力。,超氧化物歧化酶的工艺流程,动物血液材料中制备超氧化物歧化酶分离纯化工艺分为三个主要步骤：,原材料的预处理,乙醇,-,氯仿除去血红蛋白,粗酶,液的制备,有机溶剂沉淀,离子交换,柱层析精制,SOD,成品,原材料的预处理,材料,材料试剂：,3.8%,柠檬酸三钠，,0.9%,氯化钠，,95%,乙醇，氯仿，牛血。,器材：恒温水浴，离心机，布氏漏斗，抽虑瓶，烧杯，量筒，搅棒,实验步骤,收集：取新鲜牛血，加入到,3.8%,柠檬酸三钠液中，新鲜猪血与抗凝液的比例为,3:1,轻轻搅拌均匀，,4000r/min,离心,20min,收集红细胞。,浮选：红细胞用,3,倍体积生理盐水洗涤，,4000r/min,离心,20min,重复,3,次。,溶血：向洗净的红细胞加入倍体积去离子水，在,5,下搅拌,30min,得到溶血物。,注意：,收集完新鲜血液后，应尽快加抗凝剂,去除血红蛋白过程中，搅拌要均匀,去血红蛋白,向溶血液中分别缓慢加入倍体积的预冷,95%,乙醇和倍体积的预冷氯仿，剧烈搅拌,15min,左右，静置,1h,然后,4000r/min,离心,20min,，除去变性血红蛋白沉淀，取清夜，过滤，收集滤液,。,1.,热变性,原材料的预处理中获得的上清液加热到,65,，保温,10min,，然后迅速冷却到室温，,3000r/min,离心,20min,，弃去沉淀物，收集上清液。,2.,沉淀,清夜在冰浴中冷却，然后在,-5,一下的操作温度下，加入倍量预冷丙酮，边加边搅拌均匀，即有白色沉淀产生，静置,23min,，迅速抽滤，弃去滤液得肉色沉淀。沉淀物用少量蒸馏水溶解，,4000r/min,离心,20min,，除去不溶物，用的缓冲液透析，即得粗,SOD,溶液,注意迅速冷却至室温,沉淀过程保持低温哦,三材料器具,材料：动物新鲜血液；,Sephadex,G,75,凝胶。,仪器：高速组织捣碎机；高速冷冻离心机；层析柱（,1,40cm,）；自动部分收集器；恒流泵；进样器和微量进样器；可见,/,紫外分光光度计。,试剂：（,1,）,pH7.8, 5mmol,/,L,磷酸缓冲液（内含,1mmol,/,L EDTA,）；,（,2,）,考马斯亮蓝溶液：称取,100mg,考马斯亮蓝,G,250,于,50ml 95%,乙醇中，摇动，待溶解后，加入,100ml 85%,磷酸，反复震动后加蒸馏水定容至,1000ml,过滤待用；,（,3,）,pH8.2, 50mmol/L,Tris-HCl,缓冲液；,（,4,）,50,mmol/L,邻苯三酚溶液；,（,5,）,10mmol/L,HCl,溶液,4.,试剂的配法,（,1,）、,50mmol/LTris-HCl,称取,Tris,，用双蒸水溶解至,80mL,左右，用,HCl,调节（用,pH,计校正），最后定容至,100mL,。 （,2,）,10mmol/LHCl,（,3,）,50mmol/L,邻苯三酚 称取邻苯三酚，用,10mmol/LHCl,溶液溶解，定容至,10mL,，避光保存。 （,4,）,SOD,样液,四,.,实验操作,(,一,),SOD,的提取,取,新鲜血液,冷水浸泡,24h,沥干，加冰冻的,5mmol,/,L,磷酸缓冲液适量，用高速组织捣碎机捣碎。,用高速冷冻离心机以,8000rpm,离心除去固型物（需,45,次，每次,15min,）,上清液即,SOD,酶液。,（二）,SOD,的凝胶层析分离纯化,1.,凝胶的准备：,（,1,）称取,Sephadex G75,干凝胶,2g,，加适量洗脱液沸水浴溶胀,2,小时（也可室温溶胀,24,小时）。,（,2,）用倾斜法倾去表面悬浮的细小颗粒，室温储存于磷酸缓冲液中备用。,2,装柱：,（,1,）将层析柱竖直固定于支架上,连接好恒流泵、部分收集器,调节洗脱液的操作压,60cm,。,（,2,）先向层析柱中加入,1/3,高度的,pH7.8, 5mmol,/,L,磷酸缓冲液,然后用大口进样器吸取上述准备好的凝胶徐徐注入柱中缓冲液内,让其自然沉降，沉降好的柱床顶部离管口,1,2cm,为宜。若高度不够，可放去部分缓冲液，搅起管中凝胶界面，继续添加凝胶。,（,3,）装毕，用,23,个床体积的洗脱液洗脱，以使床柱稳定。,3,上样：,（,1,）放去床表面上的缓冲液至与凝胶界面平齐。,（,2,）用进样器吸取酶液，加样时将进样器尖端接触柱内壁并在离床表面数毫米处随加随沿内壁转动一周，使样品尽快分布于全表面。然后打开恒流泵，待样品液面与床柱表面平齐时，关闭恒流泵，以少许（,1ml,）,缓冲液冲洗内壁数次，在打开恒流泵，放至液面与床柱表面平齐。,（,3,）先用进样器加,1cm,高度的缓冲液覆盖样品，然后加足缓冲液，连接好进液管。,4,洗脱：,开启部分收集器和恒流泵，以,pH7.8, 5mmol/L,磷酸缓冲液进行洗脱。调节流速，控制每管收集洗脱液,1ml,，每管按收集顺序做好标记。,5,洗脱液酶蛋白含量的测定：,：,（,1,）取洁净试管数支，分别加入考马斯亮蓝溶液,3ml,摇匀，将其中一支试管不加任何试液作为对照管，其余的分别加入从第五收集管起的洗脱收集液,50,l,反复摇匀。,（,2,）以对照管为调零液，用,1cm,比色杯在,595nm,波长下测定各管的,OD,595nm,值。,（,3,）合并,OD,595nm,值高的原收集液，此即纯化的,SOD,酶液。保留测酶活力。,（,4,）测定完毕，先用乙醇洗去比色杯的颜色，再用蒸馏水荡洗，用擦镜纸拭干水珠，倒扣在培养皿内。,（,5,）清理干净工作台，在仪器使用登记本上登记使用情况。,（三）,SOD,酶活力测定,在一般情况下，,SOD,活性测定只能应用,间接活性测定法,。,其测定,方法很多，常见的有,化学法,、免疫法和等电点聚焦法。其中化学法应用最普遍，化学法的原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会产生有色中间物和,O,2,-,，利用,SOD,分解而间接推算酶活力。,在化学方法中，最常用的有黄嘌呤氧化酶法，邻苯三酚法，化学发光法，肾上腺素法，,NBT-,还原法，光化学扩增法，,Cyte,还原法等。其中改良的邻苯三酚自氧化法简单易行较为实用。本实验采用,邻苯三酚自氧化方法,。,邻苯三酚自氧化法,原理,：,邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出,O,2,-,（超氧阴离子自由基），生成带色的中间产物（红桔酚），反应开始后反应液先变成黄棕色，,几分钟,后转绿，,几小时,后又转变成黄色，这是因为生成的中间物不断氧化的结果。本实验中测定的是邻苯三酚自氧化过程中的,初始阶段,，中间物的积累在滞留,30,45s,后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在,4min,的范围内，中间物在,325nm,波长出有强烈光吸收。当有,SOD,存在时，由于它能催化,O,2,-,与,H,+,结合生成,O,2,和,H,2,O,2,，从而阻止了中间有色产物的积累，导致吸光值下降因此，通过测定它们在特定波长下得光吸收变化速率计算出,SOD,的酶活性 。,邻苯三酚,O,2,-,+,红桔酚,（自氧化：有色物质积累，吸光值增加）,O,2,-,+ O,2,-,+2H,+,H,2,0,2,+O,2,（,SOD,催化：阻止中间产物积累，吸光值降低）,SOD,实验步骤：,1,测定邻,苯三酚溶液,自氧化速率,：,取两支试管按右表加入,25,预热,过的缓冲液,然后加入预热过的邻苯三酚（空白管用,10mmol/LHCl,代替邻苯三酚），,迅速摇匀,，立即倾入,1cm,比色杯中，在,325nm,波长处测定光吸收值，每隔,30s,读数一次，测定,4min,内每分钟光吸收值的变化。要求自氧化速率控制在每分钟的光吸收值为,0,士,（可增减邻苯三酚的加入量，以控制光吸收值）。,2.,SOD,样液活力测定：,样品管取代自氧化管。样品管测定时先加入,预热,的待测酶液，在,25,水浴锅中保温,10min,，再加入预热的邻苯三酚。其余步骤同邻苯三酚自氧化速率的测定 。,3.,数据处理,3.1 加入SOD酶前后邻苯三酚自氧化速率的计算,3.2,SOD,酶活力计算：,(酶活力单位定义:在一定条件下,每1mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50 %时的酶量定义为一个活力单位。),SDS-PAGE,技术及原理,酶固定化技术,酶固定化技术,邻苯三酚的自氧化曲线,缓冲液,4.5mL 45mL,邻苯三酚溶液,0.01mL),Back,SOD,酶对邻苯三酚自氧化的抑制,酶活力测定曲线,Back,清 场,各组将实验台清理好，实验用具清洗干净，恢复实验开始时的状态。,派人清扫实验室。,色谱法,纯化超氧化物歧化酶,操作步骤,1,、,DEAE-,纤维素的预处理：,DEAE-纤维素,2,、装柱,（,1,）层析柱用洗涤液洗清洁，柱的下端联接塑料管，装上螺旋夹。关上螺旋夹，柱内装入缓冲液,I,，微开螺旋夹。让缓冲液缓慢流出，赶走死区及塑料管中的气泡，柱中保留少量缓冲液，关闭螺旋夹。,（,2,）将基本平衡好的,DEAE-,纤维素浆液（约有,1,倍体积的缓冲液,I,）放在抽滤瓶中减压除尽气泡，然后沿管壁倒人柱中，待沉降至床高约,1cm,高度时，部分旋松螺旋夹，让溶液缓慢流出去，注意此时的流速要比正常洗脱时的流速慢，陆续加入较多的浆液，直至达到高,10cm,以上的柱床体积。,层析柱,3,、,平衡,当全部交换剂装入柱中后，用上柱起始缓 冲液进行平衡。流速可维持在,4mL/15min,，直至流出液的,pH,与上柱缓冲液完全相同。（一般要平衡,8h,以上或过夜。）,4,、,层析,用毛细吸管小心吸去交换剂上面大部分液体，打开出口使缓冲液,恰流到表面，关闭出口。用毛细吸管小心地沿柱壁四周缓缓加入,SOD,粗酶液，打开出口，使样品溶液进入纤维素内，至几乎露出床面时，柱壁用少量缓冲液小心洗涤,2,3,次，然后装入缓冲液,，使液面高出创面,2,3 cm,左右。,5,、洗脱,（,1,）按图,8-9,将梯度洗脱器和层析柱连接好。,（,2,）在洗脱瓶,A,（贮存器）和洗脱瓶,B,（混合器）内各装入,100mL,缓冲液,和缓冲液,，注意两洗脱瓶，特别是液面应处于同一水平面，同时应排除连接管内气泡。,（,3,）开动电磁搅拌器开关，调节搅拌速度，以混合器内缓冲液旋转而无明显旋涡为宜。,（,4,）将两瓶和柱上下连接管道打开，开始收集洗脱流出液，控制流速在,min,。 收集液测定蛋白质浓度和酶活性。,（,5,）收集合并具有,SOD,活性部分的洗脱液，透析浓缩后冷冻干燥即得纯化,SOD,（淡蓝绿色产品）。,SOD,等电点的测定,（一）,SOD,等电点的测定,（,1,）取同样规格的试管,4,支，加入各试剂，然后混匀。此时 4个管的,pH,依次为5.9、5.5、4.7、3.5。,（2）,各加,SOD,的醋酸钠溶液1,mL，,加一管，摇匀一管。观察其混浊度。静置10分钟后，再观察其混浊度。最混浊的一管,pH,即为酪蛋白的等电点。,（,二）蛋白质的沉淀及变性,1,、蛋白质的盐析,蛋白质的盐析: 无机盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）的浓溶液能析出蛋白质。盐的浓度不同，析出的蛋白质也不同。如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才能析出。,盐溶:由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。,于试管中加入蛋白质溶液,5,mL,，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。倒出少量混浊沉淀，加少量水，观察是否溶解，为什么？将管内容物过滤，向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止。此时析出沉淀为清蛋白。取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀的再溶解。,点样,加样,样品迁移方向,电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。,混合样品,带孔胶,按分子大小分离,电泳方向,电泳,小分子,大分子,Thank You,The end,