琼脂糖凝胶电泳技术原理和方法

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,实验三,琼脂糖凝胶电泳技术的,原理和方法,主讲教师和实验员：张运峰,一 实验目的,学习琼脂糖凝胶电泳分离,DNA,的原理和方法,检测碱裂解法提取质粒的结果,检测双酶切法鉴定重组质粒的结果,（后续实验）,检测,PCR,法鉴定质粒的结果,（后续实验）,二 实验原理,（,1,）某物质在电场作用下的迁移速度叫做电泳的速率，电泳的速率与核酸分子大小和构型有关。,DNA,分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。,分子质量越小跑得越快，紧密构型快于松散型开环分子或线性分子，从而可以分离大小不同的,DNA,或,RNA,分子。,（,2,）琼脂糖是一种,线性多糖聚合物,，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于,琼脂糖的浓度,。,浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。,琼脂糖浓度,(%),线型,DNA,分子的分离范围,(Kb),0.3,5,60,0.6,1,20,0.7,0.8,10,0.9,0.5,7,1.2,0.9,6,1.5,0.2,3,12.0,0.1,2,配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的,DNA,分子大小来确定。,琼脂糖是一种线性多糖聚合物。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。,（,3,）溴化乙锭为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。,EB,可与,DNA,分子形成,EB-DNA,复合物，其荧光强度与,DNA,的含量成正比。据此可判断,DNA,分子量大小和粗略估计样品,DNA,浓度,。,表,1,琼脂糖凝胶的浓度与,DNA,分子大小的关系,三 仪器、材料与试剂,1.,质粒样品、酶切样品和,PCR,样品。,2.,凝胶电泳系统和电泳图像分析系统,(,凝胶成像系统,),等。,3.,琼脂糖、,1XT,AE,电泳缓冲液、,Goldview,、,6X,载样缓冲液 （,6X loading buffer,）和,DNA,分子量标准（,Marker,）等。,1.,凝胶电泳系统,DYY-6C,型 双稳定时电泳仪电源（北京六一）,输出范围（显示分辨率）：6-600V(1V) 4-400mA(1mA)240W,美国,Bio-rad,伯乐 小型水平电泳槽,Mini-Sub Cell GT Cell,2.,凝胶成像分析系统,一个已知分子质量的,DNA,样品做最对照，用来确定待测样品的相对分子质量。,4.,常用电泳缓冲液,缓冲液,缓冲容量,迁移速度,分辨率,用途,TAE,最低,最快,(,高,10,),高分子量高,高度复杂,DNA,混合物；超螺旋,DNA,TBE,很高,较慢,低分子量高,价格昂贵，不常用,TPE,电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖,400,组成上样缓冲液。,作用：,增加样品比重，以确保,DNA,均匀沉入加样孔内。,形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。,使样品呈色，使加样操作更方便。,5.,上样缓冲液,4.,常用核酸染料,名称,优点,缺点,EB,（溴化乙锭）,染色操作简便，快速，室温下15-20,min；,不会使核酸断裂；灵敏度高，10,ng,或更少的,DNA,即可检出；可以加到样品中或胶中。,EB,是诱变剂，使用时一定要戴手套。,EB,废液要经过处理才能丢弃。,Gldview,低毒，灵敏度较高的染料；可以加入样品中。,dsDNA,呈现绿色荧光,而,ssDNA,呈红色荧光,能较好地区分,dsDNA,与,ssDNA,。,价格稍高，灵敏度 较低。背景强烈。,SYBR,新型低毒，高灵敏度染料，可以加入样品中。,价格昂贵。对小于,50 bp,染色缺失，小于,100,的染色效果较差。稳定性差,Genefinder,花青类染料,毒性很低；最大吸收峰为,470nm,。具有安全、灵敏、经济的特点,重复性较差。能引起有机体突变。,溴化乙锭,溴化乙锭,（ 3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴盐,EB）,，,EB,染色（,EB,可很好地掺入到双链,DNA,中），在紫外光下会发出橙红色的荧光，用于对,DNA,进行染色和观察。,用于观察的紫外光有种波长，一般使用中波紫外光（,302nm,）。短波紫外光（,254nm,）观察效果较好，但对,DNA,的破环很大。长波紫外光（,366nm,）：回收。,1.,制备琼脂糖凝胶（,1%,）,2.,制备凝胶板,3.,加样,4.,电泳,5.,染色,6.,结果观察,四,.,实验步骤,1.,制备凝胶和胶板,：,琼脂糖（ 三角瓶,），煮胶，溶解，冷却至,60(,不烫手,),，倒板，室温下充分凝固，竖直拔下梳子 。,胶板设计（,27,人）：,每,11,孔胶板（,4,人：,2,样品,+1marker,）。,5l,质粒,DNA+1l loading buffer,混匀；,15lPCR,产物,+3l loading buffer,，混匀；,10l,酶切产物,+2l load- ingbuffer,混匀；,5l DNA Marker(,每板胶一孔,）,2.,加样,3.,电泳,电压,3-5V/cm,，约,80-90V,，注意电极方向,4.,观察,紫外透射分析仪下观察。,六 实验结果,琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的,中性物质,，不带电荷。琼脂糖链依分子内和分子间氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。,琼脂糖凝胶结构形成过程,琼脂糖单糖分子结构,琼脂糖粉形成琼脂糖凝胶的过程,DNA,分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。,DNA,分子在高于等电点的,pH,溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，,DNA,分子的迁移速度取决于分子筛效应，即,DNA,分子本身的大小和构型。当,DNA,分子大小超过,20kb,时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开，此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，应用琼脂糖凝胶电泳分离,DNA,时，分子大小不宜超过此值。,核酸分子大小及琼脂糖的浓度的关系,谢 谢！,放映结束,感谢各位的批评指导！,让我们共同进步,