第四章 水草脱毒苗

,Your site here,LOGO,LOGO,*,青岛农业大学海洋科学与工程学院,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,第四章 水草脱毒苗,第一节 水草脱毒苗培育,植物病毒病原体可通过维管束传导。因此，对无性繁殖的植物来说，一旦感染上病毒之后，就会代代相传越趋严重。,受病毒侵染的植物生长缓慢、畸形、产量大幅度下降，品质变劣，甚至完全丧失商品价值。,“脱毒苗”,是指不含该种植物的主要危害病毒，即经检测主要病毒在植物内的存在表现阴性反应的苗木。要脱除植株体内所有病毒包括未知病毒是不可能的。,脱苗可通过群体中未受病毒侵染的植株无性繁殖获得。由于病毒不经种子传播（豆科种子除外），因而也可通过种子繁殖获得无病毒植株。,（一,）,茎尖培养脱毒,（二）热处理脱毒,（三）热处理结合茎尖培养脱毒,（四）其他脱毒方法,一、 脱毒方法,1,、通过茎尖培养脱毒的原理,（,1,）病毒在植物体内的分布,茎尖、根尖分生组织不含病毒粒子或病毒浓度很低。是因为病毒在寄主植物体内随维管系统（筛管）转移在根尖与茎尖分生组织中没有维管束系统，病毒运动困难。,病毒在寄主茎尖分生组织中的转移速度落后于茎（根）尖的生长速度，导致顶端分生组织附近病毒浓度低，培养便可获得无病毒再生植株。,（一）茎尖培养脱毒,（,2,）茎尖大小与脱毒效果,用于脱毒的茎尖外植体可以是顶端分生组织即生长点，最大直径；通常是带,1,3,个叶原基的茎尖（约）。,茎尖外植体的大小与脱毒效果成反比。但不带叶原基的过小，外植体离体培养存活困难，生长缓慢，操作难度大。茎尖分生组织不能合成自身需要的生长素，而分生组织以下的,1,3,个幼叶原基可合成并供给分生组织生长素、细胞分裂素。因而带叶原基的茎尖生长快，成苗率高。但茎尖外植体过大，脱毒效果差。,1,取样：用于脱毒的植株应是患病群体中病害相对较轻的植株。可直接从选定的植株上取梢段进行消毒接种。也可从室内培养,1,2,月并进行热处理的盆栽扦插苗上，采顶芽与侧芽消毒接种。,2,消毒：剪取梢段（也可用侧芽）,3,5cm,，剥去大叶片，用自来水冲洗干净，在,75,酒精中浸泡,30s,左右，用,1,3,次氯酸钠或,5,7,的漂白粉溶液消毒,10,20min,（或用 ,HgCl,2,消毒数分钟），最后用无菌水冲洗材料,4,5,次。,2,、茎尖脱毒的方法,（,3,）剥取茎尖与接种,在超净工作台上，将已消毒的芽放在垫有无菌滤纸的培养皿中（已灭菌）。在双筒解剖镜下，用解剖针或镊子将材料固定于视野中，用解剖刀尖仔细剥去幼叶，至出现裸露的生长点。用刀尖切下带,1,2,个叶原基的生长点（约,0.5mm),。用解剖针或解剖刀尖将切下的茎尖转至培养基上（顶部向上,),，每管接,1,2,个茎尖。,为防止茎尖失水，可用无菌水润湿滤纸。操作中注意随时更换滤纸和接种工具，剥取茎尖时切勿损伤生长点。,（,4,）培养,接种后材料置,25,2,，光照度,1500,5000lx,，每日光照,10,16h,条件下培养。温度对茎尖培养的影响不及光照。不同植物茎尖培养适宜的光强与光照时间不同，但一般光照培养比暗培养效果好。,培养两个月左右，大的茎尖再生出绿芽，小的（）茎尖则需,3,个月以上，有的甚至更长时间才发生绿芽。其间应更换新鲜培养基。提高培养基中,BA,的浓度，可形成大量丛生芽。,（,5,）生根诱导,一些植物茎尖培养形成绿芽后，基部很快发生不定根。而另一些植物不产生不定根，必须将无根绿苗再诱导才能生根成为完整植株。诱导生根的方法是将,2,3cm,高的无根苗转入生根培养基，继续培养,1,2,个月即可形成根。一些植物茎尖离体培养极难生根，即使转入生根培养基诱导也难奏效（如桃、苹果），这类植物的无病毒绿芽可通过微体嫁接法获得完整植株。如果取茎尖脱毒试管苗的茎尖（可大于第一次切取的茎尖），再培养，即二次茎尖培养脱毒率可达,100,。,3,、培养基与培养方式,（,1,）培养基 合适的培养基对茎尖诱导成完整植株有重要影响。,MS,培养基适于多种植物茎尖培养。,White,、,Morel,等培养基也有广泛的应用。植物应严格控制培养基中糖的浓度。培养基中加入生长素（,IAA,、,NAA,）和细胞分裂素（,KT,、,BA,）或椰乳，对促进不同大小的茎尖外植体生长和分化是必要的。,GA,3,的适当配合，促进效果良好。,2,4-D,常导致愈伤组织发生，应避免使用。,2,培养方式,茎尖培养一般常采用半固体（琼脂培养基）培养，但去掉琼脂的液体培养基效果（滤纸桥）更好。,热处理或温热疗法。其基本原理是一些病毒对热不稳定，在高于常温的温度下（,35,40,）即钝化失活。因而将植物置于一定高温下处理一段时间后，病毒失活而植物基本不受伤害。由于通过组织培养脱毒的各种方法均有一些不足之处。这些病毒及一些类病毒难以通过茎尖培养、微尖嫁接或愈伤组织培养脱除，而用热处理则可以脱除。,（二）热处理脱毒,热处理方法,（,1,）温汤处理,将材料放置,50,左右热水中浸数分钟至几小时，可使病毒失活。此法简便易行，适于离体材料和休眠器官的处理，缺点是易伤害材料。,（,2,）热风处理,将盆栽植物移入室内或生长箱中，以,35,40,温度处理几十分钟至数月。按植物种类、器官类别和生理状况及待脱除病毒的种类等，确定处理温度与处理时间,二、热处理脱毒,1,、愈伤组织培养脱毒,2,、珠心胚培养脱毒,3,、微尖嫁接脱毒,4,、花药培养脱毒,5,、蒜薹圆盘培养脱毒,6,、化学处理,（四）其它脱毒方法,将感染病毒的组织离体培养获得愈伤组织，再诱导愈伤组织分化成苗，从而获得无病毒植株的方法，即愈伤组织培养脱毒法。,依据是愈伤组织细胞带病毒不均一，部分细胞不带病毒，由这些细胞再生出的植株是无病毒的。多次继代的愈伤组织中病毒浓度下降。甚至检测不出病毒。,1,、愈伤组织培养脱毒,一是愈伤组织细胞分裂增殖速度快，而病毒复制速度较慢，赶不上细胞的繁殖；,二是愈伤组织细胞发生了抗病毒突变。此外，在母株上也存在抗病毒的细胞，它们与感病毒的细胞并存，采用它们存在部位的组织离体培养，所获再生植株中有较高比例的无毒株。,马铃薯茎尖愈伤组织再生植株中，不含马铃薯,X,病毒（,PVX,）植株的频率高达,46,，远高于茎尖直接成苗植株的频率。,愈伤组织细胞不带病毒可能有以下两方面的原因,2,、珠心胚培养脱毒,柑橘类种子为多胚种子，除具有合子胚外，还有多个珠心胚。珠心胚由珠心组织细胞即体细胞分化形成，具有和母体相同的遗传特性。病毒一般不通过种子传播，因而通过珠心胚培养获得的再生植株是无毒的，同时又保存了母株的遗传特性。,3,、微尖嫁接脱毒,微尖嫁接技术，指在人工培养基上培养实生砧木，嫁接无病毒茎尖（，带,3,4,个叶原基）以培养脱毒苗的技术。这一方法适用于茎尖培养脱毒生根困难，不能形成完整植株的植物，如柑橘、桃、苹果等。茎尖来源包括成年无病毒植株的茎尖、热处理或温室培养植株的茎尖以及脱毒试管苗茎尖等，以热处理植株茎尖嫁接应用最广泛。,试管嫁接,（四）其它脱毒方法,无菌砧木培养 茎尖准备嫁接嫁接苗培养移植。,1,砧木培养 用新鲜果实种子去种皮后接种子含,MS,无机盐的无激素琼脂培养基上，在,252,下暗培养,2,周，再转光照培养。,2,茎尖准备 供体株多用热处理或温室培养植株，对采集的嫩稍消毒和剥取茎尖。,微尖嫁接,脱毒主要程序,3,嫁接 从试管中取出砧木，切去过长的根，保留,4,6cm,根长，切顶留 左右茎。在砧木近顶处一侧切一个“,U”,形切口，深达形成层，用刀尖挑去切口部皮层。将茎尖移置砧木切口部，茎尖切面紧贴切口横切面 。,4,嫁接苗培养 微尖嫁接苗一般采用液体滤纸桥方式培养 。事先在纸桥中开一小孔，将砧木的根通过小孔植入液体培养基，按常规光照培养管理。开始可用较低光强,800,1000lx,。长出新叶后可提高光强。,5.,移栽嫁接苗 培养,3,6,周，具,2,3,片叶时按一般试管苗移植方式移入蛭石、河沙、椰壳等基质中培养。,即将嫁接苗去根并削去砧木部分的皮层作为“接穗”，嫁接到盆栽粗壮砧木上，扎紧切口井罩以塑料袋保湿，,20d,左右成活，即可摘去塑料袋。用再嫁接式移栽的柑橘微尖嫁接脱毒苗成活率高。,“再嫁接式移栽”,4,、花药培养脱毒,1974,年日本大泽胜次首先发现，草莓花药培养可产生无病毒植株。国内外研究证实，草莓花药培养脱毒率高于茎尖脱毒率，一般可达,80,以上；有些报道指出可达,100,。因此，大泽胜次认为草莓花药培养脱毒，可以免去脱毒检测程序。草莓花药培养产生二倍体植株频率很高，且操作较茎尖培养脱毒简便。这些特点使草莓花药培养脱毒成为当前国内外草莓无病毒苗培育主要方法之一。,5,、蒜薹圆盘培养脱毒,将表面消毒的感病大蒜的鳞片（蒜瓣）切成薄片，接种在含激素的培养基上，,5d,后从圆盘表面长出半球体，看起来很像是生长点，在培养,10d,之前半球体是无毒苗的。在培养的,5,7d,后，将半球体从外植体上剥离，转移到无激素的,LS,培养基上，经过,2,周长成高约,1cm,的苗，,8,周后形成带根的高约,8cm,的试管苗。移栽到土壤中后，它们生长健康，不呈现带病毒症状。,6,、化学处理,1.,病毒抗血清预处理 用齿舌兰环斑病毒（,ORV,）的血清处理兰属离体分生组织，提高了再生株中无,ORV,的植株频率。,抑制剂处理 烟草愈伤组织培养基中加入,2-,硫脲嘧啶，可除去组织中马铃薯,Y,病毒（,PVY,）。放线菌,D,和放线菌酮能抑制原生质体中病毒的复制。,3.,三氯唑核苷：病毒唑，化学名称,1,2,4-3,唑,-3-,酰胺,-1-D-,呋喃核苷，防治动物,RNA,病毒和,DNA,病毒病的广谱性抗病毒制剂。,（一）直接检测法,（二）指示植物法,（三）抗血清鉴定法,（四）分子生物学鉴定法,（五）电镜检测法,二、,脱毒苗鉴定,直接观察植株生长状态是否异常，茎叶上有无特定病毒可见症状，从而可判断病毒是否存在。如矮缩病毒引起寄主植物叶片腿绿、坏死、扭曲、植株矮缩，花叶病毒引起寄主植物叶片脉间失绿等。,简便、直观、准确。,（一）直接检测法,对某种或某几种病毒及类似病原物或株系具敏感反应并表现明显症状的植物称为指示植物。,1,、草本指示植物鉴定,1,汁液涂抹法：取待测植物幼叶,1,3g,，加少量水及等量磷酸缓冲液磨成匀浆。在指示植物叶上涂上一薄层,500,600,目的金刚砂，用脱脂棉球蘸匀浆在叶片上轻轻摩擦，以汁液进入细胞又不损伤叶片为度。,5min,后，以清水冲洗叶面多余的匀浆及金刚砂。置放虫网内数天至数周。观察是否有症状。,（二）指示植物法,汁液涂抹法的操作步骤,2,小叶嫁接法,取待测植物小叶嫁接到指示植物叶上，根据被嫁接指示植物叶上有无病毒症状，鉴定待测植物病毒。 每株指示植物至少嫁接,2,片小叶，若待测植物有病毒，嫁接后,15,25d,，即会产生症状。,2,、木本指示植物鉴定,1,）直接在指示植物上嫁接待检植株的芽片。,）双重芽嫁接,先将指示植物的芽嫁接到实生砧木基部距地面,10,12cm,处，再在接芽下方嫁接待检植物芽，两芽相距,2,3cm,。成活后剪去指示植物芽上部砧干。夏秋季芽接，次年可观察。,（,3,）,双芽嫁接法,在休眠期剪取指示植物和待检植物的接穗，萌芽前分别把,带有两芽的指示植物接穗与待检植物接穗同时切接在实生砧木上，指示植物接穗接在待检接穗上方。,1,、原理,人和动物感病后，血清中会产生抗体。刺激抗体产生的物质多为蛋白质，称为抗原。抗原与抗体间能发生高度专一性的反应，称为血清学反应（免疫反应）。,（三）抗血清鉴定法,抗体存在于血清中，故叫抗血清。植物病毒是核酸和蛋白质组成的复合体，因此，也是一种抗原，注射到动物体内，会引起相应特异抗体的产生。因此，利用特定病毒的抗血清通讨血清学反应即可检测该种病毒。,抗血清鉴定方法专一性强、快速简便。分离纯化病毒（抗原），制备纯净的抗血清是抗血清鉴定中最关键的环节。植物病毒抗血清的制备方法是：先提取、纯化植物病毒，将高纯度病毒注射到动物（如家兔、山羊、老鼠）体内，再从动物血液中提取和纯化抗血清。,2,、方法,1,）叶绿体凝集法 采用待检植物叶片提取液与专一抗血清发生凝结反应检测植物病毒，如烟草花叶病毒，马铃薯,Y,病毒等长形病毒,2,）试管沉淀法 即各种稀释的抗血清与病毒抗原在小试管中混合反应而产生沉淀，是常用的病毒检测方法之一。长形病毒形成絮状沉淀，球形病毒形成浓密粒状沉淀。,3,）环形接口法 在毛细管或细长玻管中，抗原抗体通过扩散结合。病毒抗原位于上部呈层状，少量抗血清向毛细管渗入，至达到足够的抗原,/,抗体比率时，在该区域产生可见沉淀物。此法简单快速。,基本原理是用化学处理方法将酶与抗体（或抗原）结合，制成酶标抗体（原），这些酶标记物仍保持其免疫活性，能与相应抗体或抗原特异结合形成酶标记免疫复合物，遇相应底物时，免疫复合物上的酶催化无色的底物，降解生成有色产物或沉淀物，前者可用比色法定量测定，后者可肉眼观察或通过光学显微镜识别。,4,）酶联免疫吸附分析法（,ELISA,）,1,双链,RNA,法（,dsRNA,） 在受,RNA,病毒侵染的植物体内，有相应复制形式的双链,RNA,（,dsRNA,）存在，而在健康植株中未发现病毒的,dsRNA,。通过提取纯化待测植物,RNA,，并对其进行电泳分析，可确定有无,dsRNA,存在，从而判断待检植物是否带病毒 。,植物脱毒技术,（四）,分子生物学鉴定法,2,互补,DNA,（,c,DNA,检测法）,用互补,DNA,（,cDNA,）检测病毒的方法又称,DNA,分子杂交法。,根据碱基互补原理，人工合成能与病毒碱基互补的,DNA,（,cDNA,）即,cDNA,探针，用,cDNA,探针与从待检植物中提取的,RNA,进行,DNA,RNA,分子杂交，检测有无病毒,RNA,存在，从而确定植物体内有无该病毒。合成,cDNA,时，采用同位素标记。因而检测结果可通过放射自显影显示在图像上，直观、准确。,3,聚合酶链式反应,PCR,reverse transcription PCR, RT-PCR,（五）电镜检测法,运用电子显微镜可直接检测待检植物体内有无病毒粒体存在，并根据所观察病毒的形态、大小对病毒种类进行鉴定。完整成熟的病毒称为病毒粒体，有固定形态和大小。病毒粒体的形态有杆状、线状、球状,3,种。,ISEM,：把电镜检测与血清学方法结合建立了免疫吸附电镜检测法（,ISEM,）。,ISEM,具有更高灵敏度并能测定植物粗提取液中的病毒。,植物种质资源保存具体方法很多， 大体可分为两大类。,一类是,原境保存,，为此建立自然保护区、天然公园或就地保护处于危险或受威胁的植物；,另一类是,异境保存,，为此需要建立各种基因库， 如种子园、种植园等田间基因库及种子库、花粉库等离体基因库。,第二节 种质资源保存,野外保存植物种质资源需要大量的土地和人力资源， 成本高， 且易遭受各种自然灾害的侵袭。,种子库只能保存正常型种子，对于顽拗型、脱水敏感的种子和有性繁殖困难的植物则无能为力，而且种子库仅能保存基因，而不能保存特定的基因型材料。,自,1975,年,Henshaw,和,Morel,首次提出,离体保存,(conservation in vitro),植物种质的策略以来，该项技术受到植物界的极度重视。,植物种质离体保存：,是指对,离体培养,的小植株、器官、组织、细胞或原生质等材料，采用,限制,、,延缓,或,停止,其生长的处理使之保存，在需要时可重新恢复其生长，并再生植株的方法。,常用的离体保存方法有,缓慢生长保存,(slow growth conservation),和,超低温保存,(cryopreservation),。前者适合中短期保存， 后者用于长期保存。,一、超低温保存概述,通常将,-80,以下的温度称为超低温。超低温冷冻保存一般以液氮为冷源，使温度维持在,-196,。,生物材料在如此低温下，活细胞内的新陈代谢和生长活动几乎完全停止，处于生理停顿状态，因而可使植物材料在该温度下不会发生遗传性状的改变，但细胞活力和形态发生的潜能可保存。,3.,超低温保存的植物种类,超低温保存已涉及到不同的植物种类，如野生及人工创造的谷类、豆类、薯类、油类、糖类、纤维类、蔬菜类、果树、树木、药用植物和藻类等。,超低温冷冻保存为什么没有把细胞冻死？,细胞冰冻结冰保护性脱水理论,溶液的玻璃化理论,三、植物超低温冻存的细胞学基础,细胞冰冻结冰保护性脱水理论,常温下，细胞及其溶液处于渗透平衡的状态，当温度降到冰点以下时，首先是细胞外溶液部分“冻结”出冰；胞外溶液的浓度升高，破坏了细胞内外溶液的平衡，水分由胞内通过细胞膜向外渗透，细胞收缩，细胞内浓度提高；当温度不断降低时，冻结和渗透过程不断进行，这种过程,称为保护性脱水,。,当复温时，温度升高，冻结的冰不断融化，水分由胞外向胞内渗透，使收缩的细胞膨胀，可能恢复原状。,精确控制上述过程，能使细胞在降温、复温、渗透过程中不被损伤而死亡。,提高超低温冷冻保存的措施,由于植物细胞含水量比动物细胞高，冰冻保存难度大，如果直接将保存材料放入液氮中，组织和细胞由于细胞内水分结冰，引起组织和细胞死亡，因而，超低温保存的植物材料必须借助于冷冻防护剂。,冷冻防护剂,防护机理：,在水溶液中能强烈地结合水分子，水合作用的结果使溶液的黏稠度增加。当温度下降时，溶液冰点下降，即冰的结晶中心增长速度下降，使水的固化程度减弱。因而对于降低培养基冰点和植物组织、细胞冰点起重要作用。,冷冻防护剂的使用提高了培养基渗透压，导致细胞的轻微质壁分离，相对提高了组织和细胞的抗寒力。,常用的冷冻防护剂,渗透型冷冻防护剂,:,多为小分子中性物质，在溶液中易结合水分子发生水合作用，使溶液粘性增加，弱化水的结晶过程，达到保护的目的。,包括,二甲基亚砜（,DMSO,）（极易渗入细胞内部，可防止细胞在冷冻和融冰时，引起过度脱水而遭受破坏）,甘油,甘露醇,脯氨酸,乙二醇,丙二醇,非渗透型冰冻保护剂,:,是聚合分子物质，能溶于水，但不能进入细胞，它使溶液呈过冷状态，从而起到保护作用。此类冰冻保护剂对快速、慢速冷却均有保护效果。,常见的：,聚乙烯吡咯烷酮,(,Polyvingyl,pyrollidone, PVP),葡聚糖,(,Dextrane,),聚乙二醇,(Polyethylene glycol, PEG),羟乙基淀粉,(,Hydroxyethyl,starch, HES),四、超低温保存的方法,超低温保存的基本操作程序为：,选择适宜年龄和生长状态的冷冻材料；,对生物材料进行预处理，提高分裂细胞的比例和减少细胞内自由水的含量，使材料达到最适生理状态；,将材料装入试管或其他保存容器中，放入冰浴中；,在冰浴条件下加入,0,预冷的冷冻保护剂，冰浴放置,30,45min,；,采用不同的降温冰冻方式进行冷冻，直至最后放入液氮中，并在液氮中停留至少,1h,；,保存后的化冻，一般采取在,37,40,温水浴中快速化冻；,材料化冻后的活力鉴定，进行再培养，观察恢复生长的速度及植株的再生能力，分析冻后材料或再生植株的遗传性状。,为了使保存材料达到超低温保存所要求的生理特性，还要对材料进行预处理，总的原则是提高细胞分裂与分化的同步化，减少细胞内自由水的含量，增强细胞抗寒力。,目前主要有,3,种预处理方式：,（,1,）低温锻炼,激活植物体内抗寒机制,（,2,）继代培养,增加有丝分裂细胞数目,（,3,）预培养,培养基中加冷冻保护剂或诱导抗寒力物质,2.,冰冻方法,降温冰冻方法是影响超低温保存效果的关键因素之一。,（,1,）快速冰冻法,将材料从,0,或预处理温度直接投入液氮，其降温速度在,1000/min,以上。这个过程可以使细胞内的水分子还未来得及形成结晶中心就降到了,-196,的安全温度，从而避免了细胞内结冰的危险。此法适用于那些高度脱水的材料，如种子等。,（,2,）慢速冰冻法,采用逐步降温的方法，以,2/min,的降温速度，从,0,降到,-30,，,-35,或,-40,，随即投入液氮，或者以此降温速度连续降温到,-196,。逐步降温过程可以使细胞内水分有充足的时间不断流到细胞外结冰，从而使细胞内水分含量减少到最低限度，达到良好的脱水效果，避免细胞内结冰。这种方法适合于液泡化程度较高的植物材料，如悬浮细胞、原生质体等。,（,3,）分步冰冻法,此法将快速和慢速,2,种冰冻方法结合起来。首先用较慢的速度（,4/min,）使植物材料从,0,降至一定的预冷温度（一般为,-40,）并停留一段时间（一般,10min,左右），使细胞进行适当的保护性脱水，然后再浸入液氮冷冻。,（,4,）逐级冰冻法,植物材料经过冷冻保护剂,0,预处理后，逐级通过,-10,，,-15,，,-25,，,-35,，,-40,等，每个温度停留,10 min,左右，然后浸入液氮。,（,5,）干燥冰冻法,将样品在含高浓度渗透性化合物（如甘油、糖类物质等）培养基上培养一段时间，或者经硅胶、无菌空气干燥脱水数小时，或者用褐藻酸钙液泡包裹样品，无菌风进一步干燥，然后直接投入液氮；,或者用冷冻保护剂处理后吸除表面水分，密封于金箔中进行慢冻。,只要脱水足够，细胞内溶液浓度即可达到较高水平因而易进入玻璃化状态。这种方法对某些植物的愈伤组织、体细胞胚、胚轴、胚、花粉、茎尖及试管苗等较合适，但对大多数对脱水敏感的材料不适用。,谢谢大家！,结 语,