植物组织培养第一章

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,二级,三级,四级,五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,二级,三级,四级,五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,植物组织培养第一章,第一节 实验室及其基本设备,实验室的大小取决于工作的目的和规模：,1.,以工厂化生产为目的，实验室规模太小，则会限制生产影响效率。,2.,在设计组织培养实验室时，应按组织培养程序来设计避免某些环节倒排，引起日后工作混乱。,植物组织培养是在严格无菌的条件下进行的。要做到无菌的条件，需要一定的设备、器材和用具，同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。,实验室设计,一、准备室,作用：,材料、培养器械的清洗、培养基准备、灭菌等的准备工作,。,普通化学实验室：,仪器及设备、化学药品。,纯水仪、,冰箱、,移液枪、过滤灭菌器、电炉、微波炉、磁力搅拌器、低速台式离心机,、电脑等,。,作用：,配制培养基。,洗涤室：,清洗、贮存器皿设施、,鼓风干燥箱等。,作用：,玻璃器皿、用具和培养材料的洗涤。,自动双重纯水蒸馏器,灭菌室：,高压蒸气灭菌装置：如立式、卧式和手提式灭菌器。,作用：培养基、器械、棉塞、无菌纸等灭菌消毒,高压灭菌设备,USING,THE AUTOCLAVE,TO STERILIZE MEDIA, GLASSWARE OR OTHER LAB UTENSILS,细菌过滤器,细菌过滤器：用于液体培养基灭菌装置。,二、无菌操作室,作用：,进行植物材料分离接种的重要场所，需长时间的无菌操作，对组织培养成功起关键作用。,试验设施：,超净工作台,紫外灯,固定式和移动式载物台,消毒器、广口瓶、酒精灯、酒精棉、机械支架,手术剪、解剖刀、解剖针、镊子等,超净工作台,(,a laminar flow hood,),工作原理,:,利用,鼓风机,驱动空气,遁过,高效过滤器,除去,空气中的尘埃颗粒，,使空气得到,净化,。,净化空气徐徐通过工,作台面，使工作台内,构成,无菌环境,。,三、培养室,作用：,进行材料的培养的场所。,其大小、规模可根据工作性质设定。以充分利用空间和节能为原则。,设备：,可调控光、温、湿度等设备。,还有固定式培养架、转床、摇床。,适用于器官（芽、茎、花药等）、愈伤组织、细胞和原生质体的固体培养和液体培养。,培养细胞或组织的各种器皿,1,2,3,4,四、细胞学实验室：,作用：细胞学和组织学观察。,需备有高倍显微镜、体视显微镜、倒置显微镜、各种相机、恒温箱、切片机、恒温水浴、滴瓶、染色缸、载玻片、盖玻片等。,五、温室：,作用：培育组织与细胞培养出来的材料，组培苗的移栽锻炼。,第二节 基本操作,一、洗涤方法,1,、重铬酸钾洗液：,饱和的重铬酸钾洗液：,43,克重铬酸钾溶于,1000,毫升蒸馏水中（饱和溶液）。按,1,：,1,体积比将浓硫酸缓慢地倒入饱和重铬酸钾水溶液中。,流程：,（,12h,）,水洗 晾干 重铬酸钾洗液 自来水冲净 、蒸馏水洗两次 干燥,2,、洗涤剂：洗衣粉、洗液,3,、超声波洗净器：小型玻璃器皿，顽固性污渍。超声波除污。（要加水）,新的玻璃器皿：,HCl,浸泡,12,小时，洗衣粉、自来水洗、蒸馏水冲。,污染的玻璃器皿：,要先高压灭菌后，然后再刷洗。要避免交叉污染。,二、灭菌方法：,干热灭菌：,利用鼓风干燥箱（烘箱）进行烘烤灭菌的方法。箱内温度控制在,150,，,120min,。,玻璃器皿,.,湿热灭菌：,利用高压蒸汽灭菌的方法。一般温度为,121,，压力,，消毒,15,20min,。,培养基灭菌,.,熏蒸灭菌：,利用药物熏蒸以达到灭菌的目的。用甲醛内加入高锰酸钾、百菌清、硫磺熏蒸。用,3%,来苏尔溶液或,1%,漂白粉水溶液，或,0.2%,过氧乙酸溶液喷洒、拖擦地板。,培养室、接种室灭菌,.,过滤灭菌：,使溶液通过夹有,微孔滤膜,的漏斗，滤膜孔径需选用,。在无菌环境下，用真空泵抽滤，其滤液为无菌。,液体培养（不耐高温活性物质）,药剂灭菌：,用,70,75%,酒精、,0.2%,升汞、,10%,的次氯酸钠、新洁尔灭、,Clorox,等药剂灭菌的方法。,培养材料灭菌,。,烧灼灭菌：,用酒精灯烧灼达到灭菌的目的。,接种器具灭菌,。,射线灭菌：,用紫外线照射的方法灭菌。照射时间一般为,15,30min,。接种时应关闭紫外灯。,室内灭菌,。,三、无菌操作：,1.,接种室以及工作台灭菌：紫外灯,30,分钟，用时一定要关闭它。,2.,工作台消毒：,70%,乙醇，用小型喷壶消毒或棉球擦拭。,3.,点燃酒精灯，开启灭菌器,对使用器械进行烧烤灭菌。器械冷却后方可使用。,第三节 培养基的配置,一、培养基成分,（,culture medium,：,维持离体细胞生存和生长的溶液）,主要有：,1,、无机盐,(inorganic elements),：包括,大量元素,（,N,，,P,，,K,，,Ca,、,S,、,Mg,），,微量元素,（,Fe,、,Mn,、,Zn,、,B,、,Mo,、,Cu,、,Cl,、,Co,、,I,）。,2,、 有机化合物,（,organic compounds),：,碳源（糖类），维生素类，有机含氮化合物。,3,、植物生长调节物质,：生长素，细胞分裂素，赤霉素，脱落酸等。,4,、 附加物类：,琼脂，活性炭，椰乳，硝酸银等。,1,、无机盐,(inorganic elements),大量元素,和,微量元素,大量元素,N,：用量最多。常用的有硝态氮和铵态氮，,KNO,3,、,NH,4,NO,3,植物组织,从培养基中吸收氮后形成蛋白质。,P,：在植物组织培养在的细胞增殖分化大量需要。主要从,NaH,2,PO,4,、,KH,2,PO,4,供应。磷参与核酸、能量代谢。,K,：直接影响培养物中酶的活性。主要由,KCl,、,KNO,3,或,KH,2,PO,4,供应。,Ca,、,S,、,Mg,：,CaCl,2,、,Ca(NO,3,),2,作为,Ca,来源，,MgSO,4,作为,S,和,Mg,的来源。,微量元素,主要包括,Fe,、,Mn,、,Zn,、,B,、,Mo,、,Cu,、,Cl,、,Co,、,I,等。,植物对这些元素需要量甚微，稍多会发生毒害。,Fe,是用量较多的一种微量元素，对组织中叶绿素的合成和延伸生长起重要作用。,铁常以,FeSO,4,和乙二胺四乙酸钠,(Na,2,-EDTA),的螯合物存在于培养基中。,2,、 有机化合物（,organic compounds),有机碳源：即糖类。,作用：,维持培养基的合适渗透压对初生细胞和原生质体的完整性有,十分重要作用。另外，糖类也是合成有机物的碳源。,最常用有：,蔗糖、,葡萄糖、果糖、多糖、可溶性淀粉和糊精。,作为氮源，,蔗糖一般浓度为,2%,3%,。,糖的浓度影响组织分化类型：,在高浓度（,3%,4%,）的蔗糖有利于韧皮组织分化；,低糖浓度（,1.5%,2.5%,）时，仅生长出木质部；,适中浓度时形成具有木质部和韧皮部。,维生素类,作用：直接参与生物催化剂（酶）的形成、蛋白质、脂肪代谢等重要生命活动。,VB,1,（,Thiamine-HCl,盐酸硫胺素）,参与碳水化合物等有机物转化，促进生长素诱导不定根的发育。用量,10mg/L,。,VB,5,(Nicotinic Acid,，烟酸,),，可促进培养物生长。烟酸是尼克酰胺的前体，尼克酰胺核苷酸是脱氢酶辅酶,NAD,+,、,NADP,+,的成分。用量,1mg/L,。,VB,6,（,Pyridoxine-HCl,，盐酸吡哆醇）,参与植物氮代谢,促进愈伤组织生长、提高愈伤组织分化能力、促进培养物生长。用量,1mg/L,。,叶酸（,VB9,）,促进培养物生长，参与嘌呤、嘧啶合成。,VB12,（生物素,VH,）,培养物也有促进作用。,肌醇（,Myo-insotol ,环己六醇）,：,具有帮助活性物质发挥作用的效果，可提高,VB1,的效应。同时对促进培养物的生长，胚状体及芽的形成有良好作用。,用量：一般,50,100mg/L,。,有机含氮化合物,氨基酸：,常用的为：甘氨酸及酰胺类物质。,如,谷氨酰胺,（,Glutamine,），天冬酰胺和,多种氨基酸混合物,。,水解乳蛋白,（,Lactalbumin hydrolysate,LH,）、,水解酪蛋白,（,Casein hydrolysate,，,CH,）。,3,、植物生长调节物质,生长素：,吲哚乙酸（,IAA,）,：在培养组织中有吲哚乙酸氧化酶，可使,IAA,解体，而且也可在光下分解，用量稍高。,吲哚丁酸（,IBA,）、萘乙酸（,NAA,），,人工合成化学物质，用量低（,2mg/L,）。,2,，,4-,二氯苯氧乙酸（,2,4-D,），,作用比,IBA,和,NAA,强。,细胞分裂素：,激动素（,Kinetin,KT,）,6-,苄基腺嘌呤（,6-Benzyladenine,6-BA,）,玉米素（,Zeatin,ZT,）,2-,异戊烯基腺嘌呤（,2-Isopentenyl adenine,2iP,）,噻重氮苯基脲（,Thidiaznron,TDZ,）,（噻苯隆）,赤霉素（,GA,3,）、脱落酸（,ABA,）和多效唑（,PP,333,）等生长调节物质也在组织培养中应用。,GA3,主要用于促进试管苗的生长。,ABA,体胚的发育成熟。,PP,333,促进壮苗。,在组织培养中，,生长素,的主要作用是诱导外植体脱分化产生愈伤组织及促进培养物生长，诱导根器官的分化。,细胞分裂素,的主要作用是促进细胞的分裂和分化，诱导不定芽和胚状体的分化和形成，延缓组织衰老，增加蛋白质合成。,4,、 附加物类,常用附加物类有,:,琼脂,(Agar):,组织培养支持物,.,本身并不提供任何营养，它是一种高分子的碳水化合物，从红藻等海藻中提取，仅溶解于热水，成为溶胶，冷后,(40,以下,),即凝固为固体状的凝胶。在固体培养方式中不可缺少。一般用量为,0.5%,1.0%,，有固体条状和粉状两种。,琼脂糖,(Agerose):,可改善培养物的供氧状况。,聚乙烯吡咯烷酮（,PVP,）、维生素,C,（,Vc,）以及硝酸银等，可防止培养材料的褐变,.,活性碳,(AC),：具有吸附能力，减少有害物质的影响，如可防止酚类物质污染而引起组织褐化死亡。也有利于某些植物生根,.,用量,1-5%.,马铃薯萃取液：多用于壮苗的培养，在使用时可将马铃薯去皮、切碎、水煮,20,一,30,分钟，然后将滤液加入培养基中，其用量通常为,100,200g/L,。当培养基中添加了马铃薯萃取液后，可以对,pH,产生缓冲作用，试管苗也生长得更为健壮。,香蕉：多用于兰花的组织培养，将成熟香蕉果肉捣烂后，添加到培养基中，用量,150,200g/L,。香蕉果泥可缓冲培养基的,pH,，对外植体的分化有着较为明显的促进作用。,椰乳：,Coconut milk, CM,。用于较难培养的植物材料的培养基中。可将椰子的液态胚乳取出、或高压灭菌，或无菌过滤。使用浓度,100-200mL,L,。,二、培养基的种类,（一）常用的培养基,MS,培养基,无机盐数量适宜，硝酸盐、钾和铵盐的含量比其他培养基高。,应用最广泛。主要用于园艺植物、木本植物、花卉、蔬菜等的组织培养。,B5,培养基,铵的含量较低。在豆科植物上应用最多。,培养大豆细胞和组织培养设计。,White,培养基,成分比较简单，无机盐和糖的用量低。,（二）培养基按试验目的分为：,诱导培养基，,继代培养基，,分化培养基，,生根培养基。,诱导培养基,（脱分化培养基）：,外植体诱导发生愈伤组织的培养基。,水稻诱导愈伤组织时加,；而烟草、胡萝卜既需生长素，又需细胞分裂素。,继代培养基：,诱导出愈伤组织后，使愈伤组织能不断地生长下去的培养基。,分化培养：,由愈伤组织诱导形成小苗（幼芽或胚状体）的培养基。, 不加任何激素的基本培养基，即可诱导分化。如水稻、珍珠粟、甘蔗等植物。, 加较高浓度细胞分裂素和少量生长素培养基。如烟草、矮牵牛、四季海棠、天竺葵、菊花、倒挂金钟等组织的分化。, 只加细胞分裂素的培养基。如豌豆、油菜、小麦等。,生根培养基：,诱导再生小苗生根的培养基。,在无任何生长激素的基本培养基中就可生出良好的根系。如烟草、红薯、草莓、枸杞等。,有些需加入少量的,NAA,、,IAA,或,IBA,以诱导根。,有些需要减低培养基中无机盐的浓度。如用,MS,培养基中,1/2,或,1/4,的无机盐诱导生根，常可获得良好的效果。,生长素和细胞分裂素对拟南芥愈伤组织器官分化的影响,生长素和细胞分裂素对褐斑伽蓝叶片器官分化的影响,（三）培养基按其物理性质划分为,：,固体培养,在培养基中加入一定量的凝固剂，使液体培养基固化,一般用于组织或器官培养,.,优点：使用方便，占地不大。,缺点：培养外植体只能有部分组织与培养基接触，培养物上下部因接受养分不均匀，引起组织生长的差异。,液体培养,培养物消毒后直接置于液体培养基中培养,一般用于细胞培养。,优点：培养物吸收营养比较充分，容易获得均匀一致的细,胞群体。,缺点：转换培养基较麻烦。,液体培养又分为,静止培养,和,振荡培养,两种形式,。,静止培养,在液体培养中用滤纸做成纸桥，桥系紧贴培养液表面，四周插入溶液中，直至瓶底部，使营养液借助毛细管力渗入滤纸，培养物置于滤纸桥面，通过纸桥源源不断地供给养分。,振荡培养,将装有培养物和液体培养基的器皿置于转床或摇床上进行培养，它既能使培养物在培养过程中均匀的接触吸收培养基成分，又能保持良好的通气条件,.,摇床有旋转式、半旋转式和往复式三种。速度比转床快。,（三）培养基的筛选,筛选：,在多种培养基上培养，根据培养物的生长情况，确定较适宜的培养基。,调整：,根据培养物的生长情况或培养目的的不同，对培养基进行调整，探索新的培养基。,如：改良,MS,、改良,B,5,培养基、,N,6,培养基等。,三、 培养基的制备,（一）,母液的配制,大量元素母液：,配制原溶液的,10,50X,，依次溶解，混合定容。,微量元素母液：,一般配制,100X,，定容。称量时最好用万分之一的电子天平。,铁盐母液：,亦配制,100X,，硫酸亚铁和乙二胺四乙酸钠（,Na,2,-EDTA,）分别溶解后，混合后再螯合,30,分钟，最后定容。,有机物母液：,100X,，定容。,生长调节物母液：,浓度,1mg/ml,。,生长素类：,IAA,、,、,NAA,、,IBA,为有机酸，制备时用碱液溶解。,IAA,溶液配置：一般称,25mg,，加,3ml,，溶解后，加水定容,25ml,，即为,IAA 1mg/ml,，也可用无水乙醇溶解后定容。,细胞分裂素类，,KT,、,BA,等，一般用,溶解后加水定容。,配制母液注意几点：,配制倍数不宜过高，可避免浪费；也可避免倍数过高，吸取量相对少而影响准确性。,母液配制好后应放在,2,4,冰箱内保存。,母液贮备时间不宜过长。过长时宜出现沉淀和微生物污染。,几种培养基成分表,(mg/L),培养基 成分,Murashige&Skoog,(MS,1962),Gamborg,(B5,1968),White,(W-63,1963),N6,朱至清，,1975,）,（,NH4,）,SO,4,NH,4,NO,3,KNO,3,Ca(NO,3,),2,.4H,2,O,CaCl,2,.2H,2,O,MgSO,4,.7H,2,O,KH,2,PO,4,NaH,2,PO,4,.H,2,O,Na,2-,EDTA,Fe-EDTA,NaFe-EDTA,FeSO,4.,7H,2,O,KCl,Na,2,SO,4,Fe,2,SO4),3,MnSO,4,.4H,2,O,ZnSO,4,.7H,2,O,H,3,BO,3,KI,MoO,3,Na,2,MoO,4,.2H,2,O,CuSO,4,.5H,2,O,CoCl.6H,2,O,盐酸硫胺素,VB1,烟酸,盐酸吡哆醇,VB6,肌醇,甘氨酸,蔗糖,琼脂,pH,1650,1900,440,370,170,37.3,27.8,22.3,8.6,6.2,0.83,0.25,0.025,0.025,0.1,0.5,0.5,100,2.0,30(g),10(g),5.8,134,2500,150,250,150,37.3,27.8,10,2.0,3.0,0.75,0.25,0.025,0.025,10,1.0,1.0,100,20(g),10(g),5.5,80,200,720,17,200,2.5,5.0,3.0,1.5,0.75,0.001,0.1,0.3,0.1,3.0,20(g),10(g),5.6,463,2830,166,185,400,37.3,27.8,4.4,3.8,1.6,0.8,1.0,0.5,0.5,2.0,50(g),10(g),5.8,大量元素,微量元素,有机物,铁盐溶液,（二）培养基配制,按培养基配方浓度将母液实际用量依次加入大量筒中。,然后将蔗糖溶解加入，用蒸馏水定容至所需要的体积。,调整,pH,值（,1mol/L NaOH,或,1mol/L HCl),。,另外,琼脂溶解后的总体积计算在培养基体积中，溶解后，分装培养器皿中，加塞，准备消毒。,第四节,离体培养体系的建立,一、建立离体培养体系的基本程序,1.,无菌外植体的获得,2.,初代培养物的建立,3.,形态发生和植株再生,外植体,（离体的植物器官、组织、细胞）,脱分化,愈伤组织,再分化,器官发生：,不定根或不定芽,胚胎发生：,胚状体,植物体,二,、外植体选择的,基本原则,1.,再生能力强：,基因型；,分化程度；,发育年龄；,器官和组织的类型、部位等。,2.,遗传稳定性好；,3.,外植体来源丰富；,4.,外植体容易灭菌：,地上比地下、,一年生比多年生、,幼嫩比老龄、,健康比受伤组织灭菌容易,。,5.,外植体大小适宜：,5.,外植体大小对分化的影响,三、培养材料的灭菌,（一）灭菌的要求,消灭病菌减少对材料的损伤,（二）常用消毒剂,（三）材料灭菌过程,1,、,材料前处理：,自来水冲洗。此过程在准备室内完成。,2,、消毒液处理：,用酒精、升汞、次氯酸钙等配制好的溶液进行消毒。程序,:,首先,75%,酒精,30S,0.1%,升汞消毒,5,30min,。,3,、无菌水冲洗：,3-5,次，每次要把镊子、刀片等器械，进行酒精灯烧灼消毒。,2-3,步骤操作在超净工作台中进行。,四、污染主要类型及特征,1,、细菌：,菌斑粘液状，在材料基部挨着培养基的部位，一般短时间内可以观察到。,1-3,天。,2,、真菌：,有颜色的霉菌。时间较长才能看到。,10-30,天之后出现。,五、污染的控制,1,、操作环节：,防止污染的主要措施是：,改善环境条件。,严格执行无菌操作。,严查接种材料。,经常检查灭菌设备的质量。,检查培养容器是否存在问题。,2,、内源细菌,培养基中加入杀菌剂：,添加抗菌素（,200mg/,的青霉素）、链霉素、庆大霉素和头孢唑林钠、苯甲酸钠。, 反复茎尖培养：,致病菌在植物体内通过维管束传播，通过反复的茎尖培养既可脱除内生菌，又可脱病毒。, 降低,P,H,值：,大多数细菌在介质,P,H,小于时不能生长。培养基的,P,H,值由调至，可防止大量的细菌污染。,小 结,1.,组织培养的实验室及基本设备,准备室、无菌操作室、培养室、细胞学实验室、温室,2.,无菌操作：,洗涤、灭菌、无菌操作,3.,培养基的制备：,培养基的成分、种类、制备程序,4.,离体培养体系的建立,培养材料的选择、确定原则，影响取材部位的因素、材料的灭菌、污染的控制等。,第一章,实验室与基本操作,汇报结束,谢谢大家,!,请各位批评指正,