离心机操作及血液样本处理

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,离心机操作及血液样本处理,Part 1,血液基本成分及其分离方法,Part 2,离心机简介及使用,Part 1,血液基本成分及其分离方法,一、血液基本成分,二、血液物理性质,三、血液采集常用方法,四、血液成分分离方法,一、血液基本成分,血细胞形态、数量、比例和血红蛋白含量的测定称为血像。患病时，血像常有显著变化，故检查血像对了解机体状况和诊断疾病十分重要。,1,、红细胞,红细胞（,erythrocyte,，,red blood cell,）直径,7,m,，呈双凹圆盘状，中央较薄（,m,），周缘较厚（,m,）,红细胞的这种形态使它具有较大的表面积（约,140,m2,），便于携,O2,和部分,CO2,。,成熟红细胞无细胞核，也无细胞器，胞质内充满血红蛋白（,hemoglobin, Hb,）。,红细胞的渗透压与血浆相等，使出入红细胞的水分维持平衡。当血浆渗透压降低时，过量水分进入细胞，细胞膨胀成球形，甚至破裂，血红蛋白逸出，称为溶血（,hemolysis,）,2,、白细胞,白细胞（,leukocyte, white blood cell,）为无色有核的球形细胞，体积比红细胞大，能作变形运动，具有防御和免疫功能。,白细胞分类,光镜下，根据白细胞胞质有无特殊颗粒，可将其分为有粒白细胞和无粒白细胞两类。有粒白细胞又根据颗粒的嗜色性，分为中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。无粒白细胞有单核细胞和淋巴细胞两种。,、中性粒细胞,中性粒细胞（,neutrophilic granulocyte, neutrophil,）占白细胞总数的,50%,70%,，是白细胞中数量最多的一种。具有活跃的变形运动和吞噬功能。,细胞呈球形，直径,10,12,m,，核染色质呈团块状。核的形态多样，有的呈腊肠状，称杆状核；有的呈分叶状，叶间有细丝相连，称分叶核。,中性粒细胞异常,中性粒细胞增高见于：,a,急性感染和化脓性感染：肺炎、败血症、脓肿等。,b,组织损伤：大手术后、心肌梗塞、肺梗塞等。,c,恶性肿瘤：急、慢性白血病、淋巴瘤等。,d,各种中毒：尿毒症、糖尿病酸中毒等。,中性粒细胞减少见于：,a,某些传染病：流感、伤寒、付伤寒、麻疹。,b,某些血液病：再障、粒细胞缺乏症、白细胞减少症。,c,化疗或放疗后，抗癌药物，,X,线及镭照射。,d,其它：脾功能亢进，自身免疫性疾病，高度恶病质。,、嗜酸性粒细胞,嗜酸性粒细胞（,eosinophilic granulocyte, eosinophil,）占白细胞总数的,0.5%,3%,。与变态反应有关，并有吞噬抗原抗体复合物的作用。,细胞呈球形，直径,10,15,m,，核常为,2,叶，胞质内充满粗大（直径,m,）、均匀、略带折光性的嗜酸性颗粒，染成桔红色。,嗜酸性粒细胞异常,嗜酸性粒细胞增多见于：,a,变态反应性疾病：支气管哮喘、药物过敏、荨麻疹等。,b,寄生虫病：蛔虫病、钩虫病、血吸虫病。,c,某些皮肤病：湿疹、牛皮癣、剥脱性皮炎等。,d,某些血液病：慢粒、恶性淋巴瘤、嗜酸性粒细胞性白血症等。,嗜酸性粒细胞减少见于：,a,应用糖皮质激素、促肾上腺皮质激素。,b,伤寒、副伤寒等病患者。,、嗜碱性粒细胞,嗜碱性粒细胞（,basoophilic granulocyte, basophil,）数量最少，占白细胞总数的,0,。,细胞呈球形，直径,10,12,m,。胞核分叶或呈,S,形或不规则形，着色较浅。胞质内含有嗜碱性颗粒,嗜碱性粒细胞主要参与特殊的免疫反应。,嗜碱性粒细胞异常,增多见于：,a,慢性粒细胞白血病、嗜碱性粒细胞白血病。,b,某些转移癌及骨髓纤维化。,减少一般无临床意义。,、淋巴细胞,淋巴细胞（,lymphocyte,）占白细胞总数的,20%,30%,，圆形或椭圆形，大小不等。,T,细胞约占淋巴细胞总数的,75%,，参与细胞免疫，如排斥异移体移植物、抗肿瘤等，并具有免疫调节功能。,B,细胞约占血中淋巴细胞总数的,10%,15%,。,B,细胞受抗原刺激后增殖分化为浆细胞，产生抗体，参与体液免疫。,淋巴细胞异常,增多见于：,a,某些病毒或细胞所致的传染病：传染性淋巴细胞增多症、传染性单核细胞增多症、传染病恢复期、结核病、百日咳。,b,淋巴细胞性白血病、白血性淋巴肉瘤。,减少见于：,a,应用肾上腺皮质激素、接触放射线。,b,细胞免疫缺陷病、某些传染病的急性期。,、单核细胞,单核细胞（,monocyte,）占白细胞总数的,3%,8%,。具有游走性和吞噬作用。,单核细胞为白细胞中体积最大的细胞。直径,14,20,m,，呈圆形或椭圆形。胞核形态多样，呈卵圆形、肾形、马蹄形或不规则形等。胞质较多，呈弱嗜碱性，含有许多细小的嗜天青颗粒,单核细胞异常,增多见于：,a,某些感染：伤寒、结核、疟疾、黑热病、亚急性细菌性心内膜炎。,b,某些血液病：单核细胞性白血病、淋巴瘤、骨髓异常增殖综合症、恶性组织细胞病。,减少一般无临床意义。,二、血液物理特性,血液密度为,1.0501.060103kg/m3,，,红细胞的密度为,1.090103kg/m3,，,血浆的密度为,1.0251.030103kg/m3,。,血液的颜色,通常抽的是静脉血，所以外观看上去呈暗红色。,若血含较多的是高铁血红蛋白或其他血红蛋白衍生物，则呈紫黑色。,血浆（或血清）因含少量胆红素，看上去呈透明淡黄色；,若含乳糜微粒，则呈乳白浑浊；,若发生溶血，则呈红色血浆。,三、血液采集常用方法,红色试管帽采血管,采血管中不含任何添加剂，适用于常规生化血清检验，对检验结果无影响，缺点：离心不到位或者温育时间不够，容易形成纤维蛋白，容易堵塞设备针孔,三、血液采集常用方法,紫色试管帽采血管,采血管中含,EDTA-K2,抗凝剂，一般采取喷雾制作，使得抗凝剂均匀分布管壁，制备标本为全血，一般适用于常规的血液学检测,常用抗凝剂（,1,）,乙二胺四乙酸二钠（简称,EDTANa2,）,抗凝原理：可螯合血液中的钙离子而阻止血液凝固。,优点：抗凝作用强，且不改变血细胞的形态和体积，可防止血小板聚集。,应用：适于血液学检验，但输血不能用。,草酸盐合剂（草酸钾及草酸铵合剂）,抗凝原理：夺取血中的游离钙而形成不溶解的草酸钙，而达到抗凝。,优点：溶解度大，抗凝作用强。,缺点：草酸钾使红细胞缩小约,6,，而草酸铵可使红细胞膨胀。,应用：适于除红细胞压积容量测定的血液检验。,常用抗凝剂（,2,）,枸橼酸钠（柠檬酸钠）,抗凝原理：与血中游离钙离子形成非离子化的可溶性的枸橼酸钙复合物，从而阻止血液凝固。,优点：与血中游离钙离子结合松散。,缺点：引起水及无机盐在血细胞及血浆之间分布的改变。,应用：常用于血沉淀及输血时的抗凝，不适用于血液化学检验。,肝素,抗凝原理：阻止血中的凝血酶原转变为凝血酶，防止血凝。,优点：抗凝作用强，不影响红细胞的大小，对血液化学分析干扰少。,缺点：价格贵，抗凝时间短，其抗凝血做白细胞分数计数时，白细胞着色不佳。,应用：血液有机成分、无机成分的分析。,四、血液成分分离,1,血清血浆分离,2,白细胞分离,2.1,裂解红细胞法,2.2 Ficoll,分离法,1,、血清血浆的分离,血清和血浆的最大区别就是血清中不含纤维蛋白原,紫色采血管颠倒混匀后，,1200g,离心,10min,，,4,度，取上清。,红色采血管需用枪头搅匀后，,1200g,离心,10min,，,4,度，取上清,、白细胞分离,-,裂解红细胞法,红细胞裂解液主要成分：,NH4Cl,，,KHCO3,，,Na2EDTA,红细胞裂解液裂解原理：氯化铵通过在其细胞膜进行氢氧根碳酸氢根和氯离子的交换，改变其渗透压，造成红细胞胀大破裂；外周血淋巴细胞受影响较少因其细胞膜的离子转运通道不同。,、白细胞分离,-,裂解红细胞法,主要实验流程：,将,10X,储存液稀释到,1X,工作浓度；,加入血沉棕黄层的,6-10,倍体积的,1X,红细胞裂解液，吹打均匀,冰上裂解,10,分钟。裂解完毕后，,50ml,离心管中液体应呈透明红色，且下方无红色沉淀。,1500g,，,10min,，,4,度离心，弃去上层液体，仅保留下层白色沉淀。,、白细胞分离,- Ficoll,分离法,原理,:,常用来分离人外周血单个核细胞（,PBMC,）的分层液比重是,1.0770.001,的聚蔗糖,(Ficoll)-,泛影葡胺,(Urografin) (F,H),分层液。,Ficoll,是蔗糖的多聚体，中性，平均分子量为,400,000,，不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。,、白细胞分离,- Ficoll,分离法,Part 2,离心机简介及使用,1,、离心机简介,离心机 借助转轴高速旋转产生离心力，使不同密度、不同大小的物质分开，能达到初步分离纯化的目的，是实验室必不可少的仪器。,按照转速可以分为低速,(50000),三种类型。根据体积大小和摆放位置又可分为台式离心机 和落地式离心机。台式离心机体积比较小，常是中低速离心机 ；落地式离心机体积较大，常带有降控温装置，大多是高速离心机 。,2,、离心机的摆放,离心机一般放在干燥、避免阳光直射的地方。,离心机散热量比较大，周围不要堆放杂物，四周离墙壁、挡板等不透气、散热性差的物品至少,10cm,以上。,离心机尽量单独放在一个房间，周围绝对不要放有机试剂、易燃品,3,、离心机使用注意事项,根据实验所需和使用的离心管，含有有机试剂的液体要用特殊的离心管；,选择合适的转头，转速绝对禁止超过转头标明的最高转速。,离心管的对称放置和重量配平，同时应该注意离心管和转头可以承受的最大重量的溶液，液体最多装离心管全体积的,3/4,。,4,、离心机保养,每次使用完毕，都要将离心机盖儿打开，使得热量或者水气自然蒸发，如之前使用了低温离心，可能有结冰，则要等冰融化，及时用干燥棉纱布擦洗干净，等无明显水汽时再盖上盖子。,如果离心机转头可以替换，则每个转头使用完毕后都要及时取出，用干净的、干燥的医用纱布擦洗干净，倒扣放置，切勿使用锐器刮擦。,操作人员离开时候要切断电源。,5,、具体操作流程（,1,）,1.,设定使用温度 （通常为,4,）后，先把离心陀放入离心舱中，注意离心陀要卡好轴心；关上舱门，离心舱的温度开始下降，预冷时间要充足。,2.,把样本装入适当的离心管，双双用天平平衡重量，盖上离心管盖子并旋紧。,1,） 注意离心管只装七成满，虽然加有盖子，但也可能因离心力太强而外泄。,2,）离心管通常都会放在碎冰上，注意取出平衡时，要把碎冰的液体擦拭干净。,3,）落单的离心管要用另一只装有清水的离心管平衡。,3.,把平衡好的离心管对称地放入离心陀中，盖上离心陀的盖子，注意有无旋紧。,4.,关上离心机舱门，在仪表板上调好所要的转速与时间。,5.,确定所有步骤无误后，按,Start,钮开动，离心机渐渐加速，此时要密切监控。,1,）如在运行中听到不正常声音或者闻到什么异味，应立即采取刹车，按“停止”键，必要时还要切断电源。,2,）仪器运行期间，绝对禁止打开离心机盖,3,）等到离心达到所要的转速后，确定一切正常才可离去,5,、具体操作流程（,2,）,6.,完成离心时，要等离心陀完全静止后，才能打开舱门；请尽快取出离心管，先观察离心管是否完全，以及沉淀的位置。,1,）若不慎将上清和沉淀混在一起，就要重来一次。,2,）若离心管有漏，要找出原因，并且立刻清理离心陀或离心舱。,在两次离心之间的空档，不需取出离心陀，但盖上舱门，勿让热空气流入离心舱。,全部使用完毕后，取出离心陀清理。离心舱门要打开，等结冰融化后，再稍加擦拭及清理，若有液体漏出，要用清水洗之。也要回头检查平衡离心管的天平以及桌面。,实验室人员养成良好的登记习惯，第一可以知道之前谁用过，之前用时仪器状况；第二可以知道离心机使用的次数，从而得知是否需要检修或者更换。,谢谢观赏,