第十四章超敏反应性疾病免疫学检验

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,第十四章超敏反应性疾病免疫学检验,超敏反应：,已经致敏的机体再次接受相同抗原刺激后，所引起的以生理功能紊乱或组织损伤为主的异常的适应性免疫应答。,第一节 激发试验,激发试验（,provocation test,）,是模拟自然发病条件，用少量超敏原引起一次较轻的超敏反应发作，达到确定超敏原的一种体内试验。,非特异性激发：,是用组胺等刺激物做雾化吸入，,以观察患者对,型超敏反应的敏感性，进而分,析病因或判定疗效。,特异性激发：,是用抗原如尘螨等做试验，对明确,超敏原有一定价值。,用于,型和,型,超敏反应性疾病的检查。,收集原料 粉碎、匀浆 脱脂、提取,过滤、分离 鉴定 分装、保存,清毒试验部位,抗原的制备,皮试,前臂曲侧、上臂、背部,禁忌：,皮肤患湿疹、感染、皮炎或外伤,正在或近日服用免疫抑制剂或抗组胺药物,皮肤试验的类型与方法,皮内试验（,intracutaneous test,）；,挑刺试验（,pricktest,） 主要用于,型超敏反应,斑贴试验（,patchtest,） 主要是检测,型超敏反应,针,相同超敏原不同稀释度,速发型,15,30min,内观察,迟发型,48,72h,内观察,4mm/,针,方法,结果,一、皮肤试验,-,皮内试验,比皮内试验敏感性稍低，但假阳性较少；,皮试液浓度要比皮内试验高,10,100,倍。,将试验抗原与对照液分别滴于试验部位的皮肤上,用针尖透过液滴轻挑一下,以刺破皮肤而不出血为度,1min,后拭（吸）去试验抗原液,一、皮肤试验,-,点刺试验,皮内试验较点刺试验有更好的敏感性,第一次读：,48,小时打开斑试器,间隔,30min,待斑试器,压痕消失后判定结果。,第二次读：第,3,天或第,4,天。,如怀疑光过敏，在斑贴试验的基础上给予紫外线照,射，操作过程相似。,一、皮肤试验,-,斑贴试验,假阴性出现的常见原因：,皮试液的浓度过低或失效；,老年患者或过敏性休克或哮喘大发作之后；,皮试前用过抗组胺药或免疫抑制剂；,操作不当将皮试液注入皮下或注入量过少等。,结果分析及注意事项,结果分析及注意事项,假阳性出现的常见原因：,皮试液含有非特异性刺激物；,患者患有皮肤划痕征；,操作手法较重；,注入量较大或浓度过高；,注入少量空气等。,询问病史,阳性对照,必备抢救药品和设施,如何避免假性结果的出现：,适应证,阴性对照,皮试液浓度,皮肤试验的应用,预防药物或疫苗等过敏,防治,型超敏反应性疾病,结核菌素试验,评估机体细胞免疫功能,预防皮肤接触过敏,结核菌素试验,是用结核菌素进行皮肤试验，通过观察局部是否出,现迟发型超敏反应，判断机体有无结核分枝杆菌感,染和对该菌的免疫力。,阳性：,机体已感染过结核杆菌或,BCG,接种成功；,强阳性：,可能有活动性结核病；,阴性：,机体未感染过结核分枝杆菌，,但应考虑：,感染初期；,老年人；,重度结核病患者，机体处于免疫反应低下状态；,患有其他疾病。,结核菌素试验,手捏式雾化器,二、支气管激发试验,（,bronchial provocative test,BPT,）,雾化抗原颗粒,5,微米,测定肺功能指标：,用力肺活量,(FVC),1,秒用力呼气容积,(FEV1),最大呼气流速,(PEF),比气道传导率,(sGaw),射流雾化器,二、支气管激发试验,（,bronchial provocative test,BPT,）,测基础肺功能,激发物稀释液：,低浓度,/,小剂量双倍浓度,/,剂量递增,阳性伴明显气促、喘息,口吸入,1,1,分半钟,测定肺功能,阳性标准,/,明显不适,/,临床症状,直至,激发物达到最高浓度,阴性反应,支气管,舒张剂,吸入,二、支气管激发试验,（,bronchial provocative test,BPT,）,支气管反应有三种类型：速发、迟发和双重反应。,每次观察不能小于,24,小时。,FEV1,：,重复性好，结果稳定；,PEF,：,峰流速仪价格低廉、方便、不受场地限制，,与,FEV1,有较好的相关性，适合流行病学调查；,sGaw,：,敏感性好，但重复性稍差。,测定指标,二、支气管激发试验,（,bronchial provocative test,BPT,）,结果判断：,变应原的确定常以定性试验判断结果。,阳性：,气道反应性增高,FEV1,、,PEF,较基础下降,20,或,sGaw,下降,35%,，,有时伴有明显自觉症状或肺部闻及哮鸣音。,定性判断,二、支气管激发试验,（,bronchial provocative test,BPT,）,结果判断：,阴性：,气道反应性正常,FEV1,、,PEF,或,sGaw,上述标准，正常值为阴性。,无论激发试验阳性或阴性，均应排除气道反应性的影响因素。可疑者，间隔,2,3,周后复检或,2,个月后再测。,受试者在心肺功能不全、高血压、甲亢、妊娠、严重咽喉炎、呼吸道感染或肺炎等情况下一般不适宜作激发试验；,有过敏性休克，严重的血管性水肿及严重的喉头水肿病史者；,一周之内预防接种、职业性过敏因素的接触等。,禁忌证,二、支气管激发试验,（,bronchial provocative test,BPT,）,注意事项及禁忌症：,受试者在检查前：,48,小时：停,！,抗组胺药、色甘酸钠及皮质激素类药,;,12,小时：停,！,支气管扩张剂,;,15,分钟：实验室休息,病史、体检排除,BPT,的禁忌证。,注意事项,二、支气管激发试验,（,bronchial provocative test,BPT,）,注意事项及禁忌症：,有一定的危险性，但较皮肤试验的特异性高,与受试者的病史、症状和体征相关性较强,确定支气管哮喘的过敏原，尤其皮试结果不肯定时,排除皮试时的假阳性反应和假阴性反应,检测新制剂的抗原性、平喘药疗效及观察脱敏效果,缺点是每次仅能用一种抗原，要专门设备和技术，并需对病人进行训练并与之配合,二、支气管激发试验,（,bronchial provocative test,BPT,）,应用与评价：,观察症状,症状好转,或减轻,导致,基础,饮食,吃可疑的,过敏食物,症状加重,1,周后,疑似,过敏原，重复,3,次,确定,某食物为过敏原,症状未减轻,1,周后,排除,食物所致过敏,三、食物激发试验,口腔激发试验,将超敏原直接与口腔黏膜接触，当口腔黏膜出现肿胀和充血时，可判断为阳性反应。,结膜激发试验,将超敏原滴于一眼，阳性反应为结膜充血、水肿、分泌增加、搔痒，甚至眼睑红肿。注意假阳性对结果的干扰。,鼻黏膜激发试验,将抗原吸入,/,滴入受试者鼻腔，出现鼻黏膜水肿、苍白、鼻痒、流涕、喷嚏为阳性。,四、其他方法,结果判定及分析,型超敏反应,抗原刺激后,20,30min,内观察结果。,阳性反应：,点刺试验以红晕为主,皮内试验以风团为主,结果判定及分析,型超敏反应,接触抗原后,48,72h,内观察结果。,阳性反应：,皮内试验以红肿和硬结为主,斑贴试验以红肿和水疱为主,假性结果,假阴性,：,试验抗原浓度过低或因各种原因失效；正服用免疫抑制剂或抗组胺药物；操作误差 ；皮试季节选择不当 。,假阳性 ：,试验抗原不纯，引起交叉反应；试验溶液配制不当，产生非特异性刺激；皮肤反应性过强；操作不当。,第二节,IgE,的检测,一、血清总,IgE,的检测, ELISA,双抗体夹心法：操作简便，敏感性很高，是,测定血清,IgE,最常用的方法,。, CLIA,：敏感度更高，特异性高，定量。,临床意义,：正常人群血清,IgE,水平受地域环境、种,族、遗传、年龄、性别、寄生虫感染、测定法及取,样等影响，结果有一定差异。,参考值,某些过敏体质者高于正常,1000,10000,倍,血清,IgE,高,特应症、支气管肺曲菌病、,药物性间质性肺炎、麻风、,寄生虫病及,IgE,型骨髓瘤等,一、血清总,IgE,的检测,总,IgE,：,正常成人血清含量为,20,200IU/ml,婴儿血中,IgE,含量极低；,寄生虫感染时可显著增高。,sIgE:,ECP(,嗜酸性细胞阳离子蛋白）：,放射免疫吸附剂试验,（,radioimmunosorbenttest,，,IRST,）,酶联免疫测定法,(ELISA),化学发光,固相荧光免疫分析,一、血清总,IgE,的检测,临床意义,：,1,、正常人群,IgE,水平受环境、种族、遗传、年龄、检测方法及取样标准等因素的影响,2,、,IgE,升高相关的常见疾病有：过敏性哮喘、季节性过敏性鼻炎、特应性皮炎、药物性间质性肺炎、支气管肺曲菌病、麻风、类天疱疮及某些寄生虫感染等。,一、血清总,IgE,的检测,酶联免疫吸附试验（,ELISA,）：常用间接法。,免疫印迹技术,（,IBT,）：,操作简单，能一次性测定多种变应原的特异性,IgE,，故临床已普遍采用,IBT,法。,二、特异性,IgE,的检测,（,+,）,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,E,Y,E,Y,E,Y,Y,Y,Y,E,Y,E,Y,E,洗涤,洗涤,洗涤,结果,ELISA,间接法检测特异性,IgE,特异性变应原加入待检血清,转印至,NC,膜,NC,膜,待检血清,特异性,IgE,抗,-,IgEHRP,底物,特异性抗原,条带显色,NC,膜,变应原,特异性,IgE,抗,-IgEHRP,IBT,检测特异性,IgE,目前公认的检测,I,型超敏反应方法之一；,具有特异性强、敏感性高；,影响因素少、对患者绝对安全等优点；,过敏性哮喘诊断；,寻找变应原。,缺点：,费用昂贵、花费时间长、不同试剂盒的参比血清不同不易相互比较。,二、特异性,IgE,的检测,第三节,免疫复合物,检测,抗原特异性循环免疫复合物,利用免疫复合物中抗原特异性来测,IC,。,优点：特异性高；,缺点：需制备专一的针对抗原的抗体，只能检测特定的一种,IC,，不常用。（免疫复合物中的抗原性质不太清楚或非常复杂）,抗原非特异性免疫复合物检测,不考虑免疫复合物中抗原的性质，只检测免疫复合物的总量。,根据检测原理不同，检测技术分为,：,1.,物理法,PEG,法,2.,补体法,C1q,结合试验,3.,抗球蛋白法,mRF,固相抑制试验,4.,细胞法,Raji,细胞试验,CIC,：,分子量,600kDa,以上，沉降系数,19S,；,热聚合人,IgG(heat agglutination human IgG, HAHG),：,作为参考标准品，绘制标准曲线进行,CIC,定量或测定,A,值代表,CIC,相当于,HAHG,的含量。,一、抗原非特异性,CIC,检测技术,一、抗原非特异性,CIC,检测技术,CIC,的检测方法：,按抗体分子在结合抗原后发生的,物理学和生物学特性的改变而设计。,PEG,比浊法,;, ELISA,法,;,细胞法,Raji,细胞法,;,抗球蛋白技术,mRF,凝胶扩散试验。,一、抗原非特异性,CIC,检测技术,PEG,比浊法：,1.,基本原理,聚乙二醇（,polyethylene glycol,PEG,）为不带电荷、直链大分子结构的多糖，有强脱水作用，利用,2%,4%,浓度的,PEG,可选择性沉淀大分子,CIC,。,2.,技术要点,生物化学检验。,3.,注意事项：,2%PEG,沉淀大分子,CIC,；,4%PEG,沉淀较小分子,CIC,；,超过,5%PEG,选择性沉淀,CIC,的特性消失；,温度影响极大，需进行温差校正；,低密度脂蛋白使浊度增加，空腹采血；,高,球蛋白血症和标本反复冻融浊度增加。,一、抗原非特异性,CIC,检测技术,PEG,比浊法：,一、抗原非特异性,CIC,检测技术,ELISA,法：,1.,基本原理,ELISA,法测定的,CIC,，是能够结合,C1q,的,IgG,类抗体与其特异性抗原形成的,CIC,。,2.,技术要点,将聚苯乙烯包被上,C1q,，加入受检血清，,CIC,中,IgG,的,Fc,段与,C1q,结合，再加抗人,IgGHRP,，,形成,C1q-CIC-,抗人,IgGHRP,复合物，加底物显色。,一、抗原非特异性,CIC,检测技术,灵敏度高于,PEG,比浊法，检测到，重复性好等优点；, C1q,制品不易精制,纯品不稳定，只能检出与补体结合的,CIC,。,ELISA,法：,一、抗原非特异性,CIC,检测技术,细胞法,-Raji,细胞法：,1.,基本原理,Raji,细胞是从,Burkitt,淋巴瘤分离建株似,B,细胞系，在体外繁殖传代，细胞表面有高密度的,C1q,、,C3b,、,C3d,等补体受体，而且不易脱落。,2.,技术要点,将一定量待检血清、,HAHG,和,Raji,细胞混合，使补体、,CIC,或,HAHG,与,Raji,细胞形成复合物，加入抗人,IgGFIC,，形成,Raji,细胞,补体,CIC(,或,HAHG),抗人,IgG FIC,复合物，检测荧光强度。,一、抗原非特异性,CIC,检测技术,细胞法,-Raji,细胞法：,3.,影响因素,培养条件能改变,Raji,细胞其表面受体的数量及亲和性，影响检测敏感性,;,待检血清中如有抗淋巴细胞的抗体，能和,Raji,细胞反应,;,SLE,血清中的抗,DNA,也能和,Raji,细胞反应，使测定结果偏高。,一、抗原非特异性,CIC,检测技术,细胞法,-Raji,细胞法：,4.,方法评价,敏感性高,(6mg/L HAHG),，实用性强；,缺点需培养,Raji,细胞和同位素标记抗人,IgG,，操作繁琐,;,Raii,细胞培养较困难，不易长期稳定保持其特性，培养条件受限。,一、抗原非特异性,CIC,检测技术,细胞法,-Raji,细胞法：,1.,方法评价,IgG,或,IgM,类自身抗体与,IC,中,IgG,的,Fc,段结合而不与游离,IgG,结合,的特性，,mRF,与,CIC,亲和力较强。,一、抗原非特异性,CIC,检测技术,抗球蛋白技术,-mRF,凝胶扩散试验：,1.,方法评价,IgG,或,IgM,类自身抗体与,IC,中,IgG,的,Fc,段结合而不与游离,IgG,结合,的特性，,mRF,与,CIC,亲和力较强。,一、抗原非特异性,CIC,检测技术,抗球蛋白技术,-mRF,凝胶扩散试验：,2.,技术要点,将,mRF,和待检血清中的,CIC,在琼脂凝胶中扩散，,mRFCIC,结合形,成沉淀现象，进行,CIC,定性或定量。,一、抗原非特异性,CIC,检测技术,抗球蛋白技术,-mRF,凝胶扩散试验：,3.,方法评价,敏感度较低,100mg/L,（,HAHG,），,mRF,来源受限，操作费时，难于,常规应用。,一、抗原非特异性,CIC,检测技术,抗球蛋白技术,-mRF,凝胶扩散试验：,自身免疫性疾病病程中连续动态观察或辅助诊断：,试验方法本身不完善；,IC,形成的复杂性，如在生理状态下,IC,是由各种抗原,与相应抗体所构成的，维持动态平衡。在病理状态,下往往是单一种类,IC,增高，而此种单一成分增高发,展到足以影响,IC,总体水平情况下，才能被试验检出。,二、,CIC,检测方法评价及应用,检测方法评价：,肾脏疾病：急性肾小球肾炎、移植肾、,IgA,肾病；,消化系统疾病：慢活肝炎、原发性胆淤性肝硬化；,皮肤病：荨麻疹、天疱疮、皮疹性皮炎；,型超敏反应性疾病：,SLE,、,RA,、硬皮症、自身,免疫性溶血性贫血等。,此外，,CIC,的检测对于肿瘤、肝癌、白血病、霍奇金病、神经肌肉萎缩性侧索硬化症等疾病的诊断。,二、,CIC,检测方法评价及应用,临床应用：,固定或沉积于病变局部组织中的,IC,测定常用,免疫组化技术,，如荧光免疫组化技术检测到组织标本有,Ig,和补体。受累组织的成分、构型和特定的部位可为疾病的严重程度和预后提供依据。,三、沉积于组织中,IC,的测定,第四节,抗球蛋白试验（,Coombs,试验）,类型,不完全抗体：,抗体分子较短小，只能与颗粒抗原一方相结合，不出现可见的凝集现象，但能封闭抗原决定簇，使其不能再与完全抗体结合。,抗人球蛋白试验（,antiglobulin test, AGT,）：,将人球蛋白注入异种动物，诱导动物产生,抗人球蛋白血清,（,antiglobulin serum,，,AGS),，,AGS,加入表面结合有不完全抗体的红细胞复合物中，就能出现可见的凝集现象。,作用：,检测红细胞表面结合的不完全抗体。,临床意义：,新生儿溶血症和自身免疫性溶血性贫血的诊断。,RBC,为,Rh,+,7S,的,IgG,体内发生,+,抗,IgG,体外测试,抽血,一、直接抗球蛋白试验,二、间接抗球蛋白试验,检测游离在血清中的不完全抗体或红细胞表面的抗原,RBC,为,Rh+,不完全抗体试剂,+,抗,IgG,体外测试,二、间接抗球蛋白试验,技术要点,二、间接抗球蛋白试验,结果判断,凝集为阳性，表明受检血清有不完全抗体或红细胞上有相应抗原；,同时具备阳性对照管凝集阴性对照管不凝集，如有不完全抗体，可将血清以作倍比稀释进行效价测定。,二、间接抗球蛋白试验,注意事项,在,37,水浴中，抗体吸附相应红细胞上的结合程度，与致敏的时间、离子强度有关；,离心速度和时间十分重要，原则应以最小的离心力和最短的离心时间使阳性对照管出现反应为宜。,二、间接抗球蛋白试验,方法评价,是一种极为敏感的检查不完全抗体的方法，也是,RhD,检出的确证试验。操作繁杂，受试验条件影响较大。,二、间接抗球蛋白试验,临床意义, 血液病的检测；, 鉴定血型和检查血清中不完全抗体；, 有助于,RhD,的检出，多用于检测母体,RhD,抗体；, 输血前交叉配血试验及其他特殊研究；, 及早发现和避免新生儿溶血症的发生；, 红细胞不相容的输血所产生的血型抗体进行检测。,超敏反应性疾病通过体内和体外实验，可进行变应原的相关检测，包括,激发试验,（根据刺激物不同分为非特异性和特异性激发试验，按检测部位又分为皮肤试验、支气管激发试验、食物激发试验等）；,IgE,检测,（总,IgE,和特异性,IgE,检测）；,免疫复合物检测,主要针对抗原非特异性,CIC,；,抗球蛋白试验,（直接法和间接法）；,药物过敏筛选实验,（组胺含量测定和特异性抗体测定 ）。,小结,谢谢！,