临床医学检验临床免疫学与检验

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,1,*,第四篇,临床免疫学及检验,吉普塞舞神,第一章 概述,免疫应答的过程,1、识别阶段：巨噬细胞等抗原递呈细胞对外来抗原或自身变性抗原,进行识别、摄取、降解和递呈抗原信息给T辅助细胞,（Thc）及相关淋巴细胞的过程。,2、活化阶段：B细胞接受抗原刺激后活化、增殖、分化为浆细胞；,T细胞在接受抗原刺激和协同刺激双信号后活化、增殖、,分化为效应细胞。,3、效应阶段：浆细胞分泌特异性抗体，执行体液免疫功能；T细胞中,的Th细胞分泌细胞因子等效应分子，T杀伤细胞执行细,胞毒效应功能。,吉普塞舞神,第一章 概述,免疫系统由免疫器官、免疫细胞、免疫分子组成。,（一）中枢免疫器官,1、骨髓：造血干细胞（HSC）分化、发育、成熟,2、胸腺：T细胞发育的重要中枢器官,（二）外周免疫器官及组织,1、淋巴结,2、脾：最大的外周淋巴器官,3、粘膜伴随的淋巴组织：如扁桃体、小肠的派氏集合淋巴结、阑尾,淋巴细胞再循环及归巢,淋巴细胞在体内依靠归巢受体由定居地经淋巴循环及血液循环不断往返于外周免疫器官、二级淋巴组织及全身器官组织、淋巴循环汇集于胸导管，经上腔静脉进入血液循环。,血液循环中的淋巴细胞及各类免疫细胞在毛细血管后微静脉处穿越高壁内皮细胞，进入淋巴组织及淋巴器官，再次进入淋巴循环。,吉普塞舞神,第一章 概述,免疫细胞,（一）淋巴细胞,1、T细胞：胸腺依赖淋巴细胞；约占淋巴细胞的70%75%。,T细胞受体（TCR）：又称T细胞抗原受体，是T细胞特有的表面标志。T细胞识别抗原和转导信号是由TCR特异识别MHC分子递呈的抗原肽，CD3分子转导T细胞活化的第一信号。,簇分化抗原（CD）：T细胞发育不同阶段的亚群存在不同的分化抗原，这是区分T淋巴细胞的重要标志。,2、B细胞：骨髓依赖性淋巴细胞，约占淋巴细胞的5%25%。,主要功能：产生抗体、递呈抗原、分泌细胞因子参及免疫调节。,B细胞受抗原刺激后可分化为产生抗体的浆细胞和长寿记忆细胞。,3、自然杀伤细胞（NK）,NK细胞无需抗原刺激，可非特异直接杀伤肿瘤和病毒感染的细胞，因此在免疫监视和早期抗感染免疫过程中起重要作用。活化NK细胞可分泌IFN和TNF等细胞因子，参及免疫调节作用。,吉普塞舞神,第一章 概述,免疫细胞,（二）免疫辅助细胞,1、单核-巨噬细胞系统,共同特点是表达MHC类分子及具有吞噬作用。,2、树突状细胞,专职抗原递呈细胞,吉普塞舞神,第一章 概述,免疫分子,（一）免疫球蛋白,分泌型（sIg）：主要存在于体液中，具有抗体的各种功能。,膜型（mIg）：表达于B细胞表面，称为膜表面免疫球蛋白，为抗原,受体。,化学结构：2条重链（H）和2条轻链（L）以二硫键连接在一起。,V-可变区；C-恒定区,按照体内含量的多少分为：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE,Ig的轻链分为链和链，一个天然Ig分子的两条轻链相同。,吉普塞舞神,第一章 概述,免疫分子,（一）免疫球蛋白,1、IgG：血清中含量最高的免疫球蛋白，是再次应答的主要抗体，,也是唯一能通过胎盘的抗体。大多数抗菌抗体、抗病毒抗,体都是IgG，某些自身抗体及超敏型抗体也是IgG，免疫,检测中第二抗体也以IgG为主。,2、IgA：大部分血清型Ig为单体；分泌型sIgA为二聚体。每一个sIgA,分子含一个J链和一个分泌片。sIgA性能稳定，主要存在于,胃肠道、支气管分泌液、初乳、唾液、泪液中，是参及黏,膜局部免疫的主要抗体。,3、IgM：五聚体，Ig分子中最大的，主要存在于血液。是个体发育,最早合成的抗体，也是抗原刺激后最先产生的抗体。感,染过程中IgM水平升高，说明近期感染；新生儿脐血中若,IgM增高，说明有宫内感染。,4、IgD：作用不明，B细胞膜上的IgD可作为B细胞分化成熟的标志。,5、IgE：单体结构，血清中最少。亲细胞抗体，介导型超敏反应，,在特异性过敏反应和寄生虫早期感染患者血清中可升高。,吉普塞舞神,第一章 概述,免疫分子,（二）补体系统,补体是存在于人和脊椎动物正常新鲜血清及组织液中的一组具有酶样活性的球蛋白。,补体的大多数组分都是糖蛋白，多属于球蛋白。,含量最高的补体：C3、C4,含量最低的补体：C2,补体性质不稳定，加热56、30min可使血清中绝大部分补体组分丧失活性，称为灭活。,补体的激活途径：,1、经典途径：以结合抗原后的IgG或IgM类抗体为主要激活剂，补体,C1C9共11种成分全部参及了激活途径。,2、替代途径：又称旁路途径。病原微生物等细胞壁成分提供接触面,直接激活补体C3，然后完成C5C9的激活过程。激活,物主要是细胞壁成分。,3、MBL途径：由急性炎症期产生的甘露糖结合凝集素（MBL）及病,原体结合后启动激活。,补体既可参及机体的防御效应和自身稳定，亦可引起免疫损伤。,吉普塞舞神,第一章 概述,免疫分子,（三）细胞因子,免疫细胞分泌的多肽或小分子蛋白质。,通过自分泌、旁分泌、内分泌的方式发挥作用。,按生物学功能分：白细胞介素、干扰素、生长因子、趋化因子家族、,肿瘤坏死因子、集落刺激因子。,细胞因子受体分：免疫球蛋白基因超家族、I型细胞因子受体家族、,型细胞因子受体家族、型细胞因子受体家族、,趋化性细胞因子受体家族。,（四）黏附分子,黏附分子（CAM）是介导细胞间或细胞及细胞外基质间相互结合和黏附作用的小分子多肽或糖蛋白。以受体-配体的结合形式发挥作用。参及机体免疫应答、炎症发生、凝血、创伤愈合和肿瘤转移等病理生理过程。,（五）CD抗原,人类白细胞分化抗原（HLA）是指血细胞在分化成熟及活化过程中，出现或消失的细胞表面标记分子。,吉普塞舞神,第二章 抗原抗体反应,一、抗原抗体反应的原理,抗原抗体是一种非共价结合、不形成共价键。,1、静电引力；2、范德华力；3、氢键结合力；,4、疏水作用力：是这些结合力中最强的。,亲和性：是指抗体分子上一个抗原结合点及对应的抗原表位之间相,适应而存在的引力，它是抗原抗体间固有的引力。,亲和性用平衡常数K来表示，K值越大，亲和性越强，结合越牢固。,抗体是球蛋白，溶解在水中为胶体溶液，不会发生自然沉淀。,吉普塞舞神,第二章 抗原抗体反应,二、抗原抗体反应的特点,1、特异性；,2、可逆性：亲和层析法就是利用这个原理来纯化抗原或抗体。,3、比例性：只有当抗原抗体分子比例合适时充分结合，沉淀物形,成快而多，称为抗原抗体反应的等价带；,若抗原或抗体极度过剩则无沉淀形成，称为带现象，,抗体过量时，称为前带，抗原过量时，称为后带。,4、阶段性：第一阶段为抗原抗体发生特异性结合的阶段，反应快；,第二阶段为可见反应阶段，反应慢。,吉普塞舞神,第二章 抗原抗体反应,三、影响抗原抗体反应的因素,抗体的浓度、特异性和亲和性都影响抗原抗体的反应。等价带的宽窄也影响抗原抗体复合物的形成，单克隆抗体不适于沉淀反应。,颗粒性抗原出现凝集反应；,可溶性抗原出现沉淀反应；,单价抗原及相应抗体结合不出现沉淀反应。,环境因素,1、电解质：抗原抗体发生特异性结合后，由亲水胶体变为疏水胶体，,此过程需要电解质参加，常用0.85%NaCl。,2、酸碱度：一般在pH 69之间。,3、温度：一般以1540为宜。,吉普塞舞神,第三章 免疫原和抗血清的制备,免疫原：指能诱导机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能在体内外及,抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。,一、颗粒型抗原的制备,各种细胞、细菌、寄生虫等皆为颗粒型抗原,1、细胞抗原（如绵阳红细胞）一般情况下经生理盐水或其他溶液洗净，配置一定浓度即可。,2、细菌抗原多用液体或固体培养基，经集菌后处理。,颗粒性抗原大多用静脉内注射免疫法。,二、可溶性抗原的制备及纯化,蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶、补体、细菌毒素、免疫球蛋白片段、核酸等。,胃蛋白酶或胰酶处理，可获得游离的单个细胞。,溶菌酶、蜗牛酶、纤维素酶等使细菌或组织裂解。,木瓜酶将IgG裂解成2个Fab片段和1个Fc片段；,胃蛋白酶可将IgG裂解成F（ab，）2片段及数个小片段；,胰蛋白酶可将IgG切成不规则的肽链。,吉普塞舞神,第三章 免疫原和抗血清的制备,三、半抗原性免疫原的制备,半抗原：某物质在独立存在时只具有抗原性而无免疫原性。,半抗原及蛋白质载体或高分子聚合物结合后才有免疫原性。,载体,1、蛋白质类：以牛血白蛋白最常用。,2、多肽聚合物：常用多聚赖氨酸。,3、大分子聚合物和某些颗粒。,半抗原性免疫原的鉴定,一般认为至少要20个以上的半抗原分子连接到一个载体分子上，才能有效刺激免疫动物产生抗体。因此，在半抗原及载体连接后，应测定半抗原及载体的比例。,1、吸收光谱分析法,2、放射性核素标记半抗原渗入法,吉普塞舞神,第三章 免疫原和抗血清的制备,免疫佐剂,佐剂的种类,1、化合物，如弗氏不完全佐剂,2、生物制剂，经处理改造的细菌及代谢产物，如卡介苗；,细胞因子及热休克蛋白等。,弗氏佐剂分为弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂,弗氏完全佐剂=弗氏不完全佐剂+卡介苗,使用时加入水溶性抗原并充分乳化，使抗原及佐剂形成油包水乳剂。,佐剂和抗原的比例为1:1。,佐剂的作用,1、改变抗原的物理性状、延缓抗原降解和排除，从而更有效地刺激免疫系统；,2、刺激单核-吞噬细胞系统，增强其处理和递呈抗原的能力；,3、刺激淋巴细胞增殖和分化；,4、致变抗体的产生类型和诱导迟发型超敏反应。,吉普塞舞神,第三章 免疫原和抗血清的制备,抗血清的制备,含有抗体的血清即抗血清。,抗原来源及动物种属差异越大，免疫原性越强，免疫效果越好。,R型抗血清：用家兔及其他动物免疫产生的抗体，抗原抗体反应比,例合适范围较宽，适于作为诊断试剂。,H型抗血清：用马等大型动物免疫产生的抗体，抗原抗体反应比例,合适范围较窄，一般作为免疫治疗。,某些动物体内有类似物质时，蛋白质抗原对这些动物免疫原性极差。,如：IgE对绵羊；胰岛素对家兔；多种酶类对山羊。,吉普塞舞神,免疫程序,1、免疫原的剂量：,剂量过大或过小都有可能产生免疫耐受，在一定剂量范围内，免疫原剂量越大，产生的抗体效价越高。,2、免疫途径：,皮内、皮下、肌内、静脉、腹腔、淋巴结等途径。皮内或皮下免疫时一般采用多点注射。初次免疫一般选择皮内接种，加强免疫和颗粒性抗原一般选择静脉注射。宝贵抗原可选择淋巴结内微量注射。,3、免疫间隔时间,第1次及第2次免疫间隔时间以1020天为好，第3次及以后的间隔一般为710天。,采血法,1、颈动脉采血法,2、心脏采血法,3、静脉采血法,第三章 免疫原和抗血清的制备,吉普塞舞神,第三章 免疫原和抗血清的制备,抗血清的鉴定,1、抗体特异性的鉴定,常用双向免疫扩散法，观察沉淀线。,2、抗体效价的测定,颗粒型抗原-凝集试验,可溶性抗原-双向免疫扩散试验、ELISA等,稀释方法：,将经过系列稀释的血清分别及一个浓度的抗原反应；,同时稀释抗原和抗血清，分别及不同浓度的抗血清进行双向免,疫扩散实验（棋盘滴定）,3、抗体纯度的鉴定,SDS-PAGE、双向免疫扩散试验、免疫电泳等,抗血清的保存,短期保存：28；,冷冻：-80-20，分为小包装，一般保存5年，避免反复冻融。,真空干燥：510年,吉普塞舞神,第三章 免疫原和抗血清的制备,抗血清的纯化,IgG类抗体的纯化方法有盐析法、凝胶过滤法、离子交换层析法、亲和层析法。,杂质的去除：1、亲和层析法,2、吸附剂法,吉普塞舞神,第四章 单克隆抗体及基因工程抗体的制备,杂交瘤技术：利用聚乙二醇（PEG）为细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细胞及具有体外生长繁殖能力的小鼠骨髓瘤细胞融为一体。这种杂交瘤细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔积液中即可得到高效价的单克隆抗体。,小鼠骨髓瘤细胞：次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT）或胸腺,嘧啶激酶（TK）的缺陷株,肿瘤细胞合成DNA一般有两条途径：一条是生物合成的主要途径，利用糖和氨基酸合成核苷酸进而合成DNA，叶酸拮抗物（甲氨蝶呤）可阻断该途径；另一条是替代途径，当叶酸代谢受阻时，细胞通过HGPRT和TK利用核苷酸的前体合成核苷酸，进而合成DNA。因此筛选杂交瘤细胞用HAT培养液。,HAT培养液：在基础细胞培养液内添加次黄嘌呤、甲氨蝶呤和胸腺嘧啶核苷。,细胞的选择：,有限稀释法、显微操作法、荧光激活细胞分选仪、软琼脂平板法。,吉普塞舞神,第四章 单克隆抗体及基因工程抗体的制备,单克隆抗体的特性：,1、高度特异性,2、高度的均一性和可重复性,3、弱凝集反应和不呈现沉淀反应,4、对环境敏感性,局限性：单克隆抗体反应强度不如多克隆抗体,基因工程抗体,1、人源化抗体：减少抗体异源性，利于临床应用。,嵌合抗体：从杂交瘤细胞里分离出可变区基因，及人Ig恒定区的基,因连接，表达鼠-人嵌合抗体。,改型抗体：将人抗体可变区（V）中互补决定簇（CDR）序列改成鼠,源单抗CDR序列。,2、小分子抗体：可在大肠杆菌等原核细胞内表达。,3、抗体融合蛋白：指利用基因工程技术将抗体片段及其他生物活,性蛋白融合得到的产物。,4、双特异性抗体：两个抗原结合位点具有不同的特异性。,5、噬菌体抗体库技术：可以得到完全人源性的抗体，在HIV等病毒,感染和肿瘤的诊断及治疗方面有其独特的优越性。,吉普塞舞神,第五章 凝集反应,凝集反应是一个定性或半定量的检测方法，将抗体做一系列稀释，及抗原结合产生凝集的最高稀释倍数作为其效价或滴度。,两个阶段：抗原抗体特异性结合；出现可见的颗粒聚集。,直接凝集反应,原理：细菌、螺旋体和红细胞等颗粒性抗原，在适当的电解质参及下可直接及相应抗体结合出现凝集。,抗原凝集原 抗体凝集素,1、玻片凝集试验：定性分析，一般用来鉴定菌种和ABO血型测定。,2、试管凝集试验：半定量，用定量抗原悬液及一系列梯度倍比稀释的待检血清混合，保温静置后，根据每管内颗粒凝集的程度，判断待检血清中有无相应抗体及效价。,如肥达试验诊断伤寒、副伤寒；,外斐试验诊断立克次体；,输血时的交叉配血试验。,吉普塞舞神,第五章 凝集反应,间接凝集反应,是将可溶性抗原（或抗体）先吸附于适当大小的颗粒性载体表面，然后及相应抗体（或抗原）作用，在适宜电解质存在的条件下，出现特异性凝集现象。,间接凝集反应的类型,1、正向间接凝集反应：,可溶性抗原致敏载体，用以检测标本中待测抗体的凝集反应。,2、反向间接凝集反应：,特异性抗体致敏载体，用以检测标本中待测抗原的凝集反应。,3、间接凝集抑制试验：,先将可溶性抗原（或抗体）及相应抗体（或抗原）试剂混合，然后再加入抗原（抗体）致敏的载体颗粒，则能抑制原先的凝集现象，称为正向（或反向）间接凝集抑制试验。,4、协同凝集反应：,用金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）做载体，它能够及IgG的Fc段结合，称为抗体致敏的颗粒载体。如及相应抗原接触，即出现反向间接血凝抑制试验。可用于细菌、病毒的直接检测。,间接血凝抑制试验载体常用红细胞、胶乳颗粒及明胶颗粒,吉普塞舞神,第五章 凝集反应,明胶凝集试验：血清中含有病毒抗体则呈肉眼可见的粉红色凝集。广泛用于HIV-1抗体和抗精子抗体等的检测。,自身红细胞凝集试验,抗人O型红细胞的单克隆抗体能及任何型红细胞结合，但不引起凝集反应，这种抗体及另一特异性抗体连接成的双功能抗体，可用于检测标本中的抗原。反应中的红细胞是未经致敏的受检者新鲜红细胞，因此反应中的标本为受检者的全血。可用于HIV抗体，HBsAg的检测。,抗球蛋白试验,又称Coombs试验，是检测抗红细胞不完全抗体的一种有效方法。,包括直接C试验和间接C试验，分别检测红细胞上的不完全抗体和游离在血清中的不完全抗体。,广泛应用于血液病的检测，如自身免疫性溶血性贫血、药物诱导的贫血、新生儿溶血症等，还可采用专一特异性的抗球蛋白的血清，如抗IgG血清、抗IgA或抗IgM以及抗补体血清等，分析结合于红细胞上的不完全抗体的免疫球蛋白亚类。,吉普塞舞神,第六章 沉淀反应,沉淀反应：指可溶性抗原及相应抗体在特定条件下发生特异性结合时,出现的沉淀现象。,沉淀反应的抗原多为蛋白质、多糖、血清、毒素等可溶性物质。,第一阶段：抗原抗体发生特异性结合，肉眼不可见，时间短。,第二阶段：形成可见的免疫复合物，如沉淀线、沉淀环，,约需几十分钟到数小时。,吉普塞舞神,液体内沉淀实验,抗原抗体溶液在电解质的存在下结合，形成絮状沉淀物，这种絮状沉淀受抗原抗体比例的直接影响，因此常用来作为测定抗原抗体反应最适比例的方法。,1、抗原稀释法；,2、抗体稀释法；,3、方阵滴定法（棋盘滴定法）。,免疫浊度测定本质上属于液体内沉淀反应，可进行液体中微量抗原、抗体及小分子半抗原定量检测。,抗原过量：形成IC（免疫复合物）分子小，且会发生再解离，浊,度下降，这叫做高剂量钩状效应。,抗体过量：IC的形成随着抗原的增加而增加，抗原抗体最适比例,处达到高峰，这就是经典的海德堡曲线理论。,免疫比浊法的基本原理就是在反应体系中保持抗体适当过量。,抗体的选择：特异性强、效价高、亲和力强，使用R型抗体。,pH6.58.5 使用磷酸盐缓冲液做反应液,增浊剂：聚乙二醇（PEG）、吐温-20,第六章 沉淀反应,吉普塞舞神,凝胶内沉淀试验,利用可溶性抗原和相应抗体在凝胶内扩散，形成浓度梯度，在抗原抗体浓度比例恰当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。,凝胶支持物：琼脂、琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酰胺凝胶等。,1、单向扩散试验,在琼脂内混入抗体，待测抗原从局部向琼脂内自由扩散，如抗原和相应抗体结合，形成沉淀环。,Mancini曲线（M曲线）：适用大分子抗原和长时间扩散（48h）结,果，沉淀环直径的平方及抗原浓度呈线性关系。,Fahey（F曲线）：适用于小分子抗原和较短时间（24h）扩散的结果，,用半对数纸画线，浓度对数及扩散环直径呈线性关系。,双环现象：出现两种抗原性相同成分。,第六章 沉淀反应,吉普塞舞神,凝胶内沉淀试验,2、双向扩散试验,让抗原和抗体双方都在琼脂中各自向对方扩散，在比例恰当处形成抗原抗体沉淀线，观察这种沉淀线的位置、形状以及对比关系，可对抗原或抗体进行定性分析。,平板法是最常用的方法。,抗原或抗体的存在及否以及相对含量的估计：,抗原抗体相对分子量的估计：扩散慢者圈子小，局部浓度大，形成的沉淀线弯向分子量大的一方，如果分子量大致相等，则呈直线。,抗原性质的分析：两条沉淀线相互吻合，说明抗体和两个抗原的相同表位结合而沉淀，两个抗原相同；沉淀线呈部分相切，说明两个抗原之间有部分相同；两条沉淀线交叉而过，说明两个抗原完全不同。,抗体效价的滴定：出现沉淀线最高的抗体稀释度为该抗体效价。,抗原或抗体纯度鉴定：多条沉淀线说明抗体不纯。,第六章 沉淀反应,吉普塞舞神,免疫电泳技术,1、对流免疫电泳,实质是将双向免疫扩散及电泳相结合的定向加速的免疫扩散技术。,抗原带负电荷向正极移动；抗体在电渗作用下随水流向负极。,2、火箭免疫电泳,实质是加速的单向扩散试验。,3、免疫电泳,是区带电泳及免疫双扩散相结合的免疫分析技术。,抗原经电泳分区带，沿电泳方向挖一平行抗体槽，加入相应抗血清做双向扩散，形成弧形沉淀线。,多发性骨髓瘤患者血清在免疫电泳后，可观察到异常的M蛋白沉淀弧。,4、免疫固定电泳,电泳加沉淀反应技术，可用于各种蛋白质鉴定。,先将待测样品做区带电泳，覆盖抗血清，形成抗原抗体复合物而沉淀。分辨率强，敏感性高，操作周期短，结果易于分析，目前作为常规检测。,5、交叉免疫电泳,将区带电泳和火箭免疫电泳相结合，可一次同时对多种抗原定量。,第六章 沉淀反应,吉普塞舞神,第七章 放射免疫分析,放射免疫分析（RIA）,是以放射性核素标记的抗原及反应系统中未标记抗原竞争结合特异性抗体为基本原理来测定待检样品中抗原量的一种分析方法。,免疫放射分析（IRMA）,是用放射性核素标记的过量抗体及待测抗原直接结合，采用固相免疫吸附载体分离结合及游离标记抗体的非竞争放射免疫分析法。,常用的放射性核素：125I、131I、3H、14C,放射性碘原子通过取代反应置换被标记物分子中酪氨酸或酪胺残基及组胺残基上的氢原子。,比较：IRMA反应速率、特异性、灵敏度和检测范围都较RIA高。,应用：常用于各种激素、微量蛋白质、肿瘤标志物和药物等测定。,吉普塞舞神,第八章 荧光免疫技术,常用荧光色素：,1、异硫氰酸荧光素（FITC）：黄绿色荧光，最常用；,2、四乙基罗丹明（RB200）：橘红色荧光；,3、四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）：橙红色荧光；,4、藻红蛋白（R-RE）：橙色荧光。,其他荧光物质：某些3价稀土镧系元素，其中铕（Eu3+）应用最广，其荧光衰变时间长，最适合用于时间分辨荧光免疫测定。,时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）：是一种非放射性核素免疫分析技术，用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效排除非特异性荧光的干扰，极大提高了分析灵敏度。,荧光偏振免疫测定：利用抗原抗体竞争反应原理，根据荧光素标记抗原及其抗原抗体复合物的荧光偏振程度的差异，测定体液中小分子物质的含量。常用FITC标记小分子抗原。,吉普塞舞神,第八章 荧光免疫技术,荧光酶免疫测定：利用酶标记抗原或抗体，及待检物反应，借助酶反应荧光底物，经酶促反应生成稳定且高效的荧光物质，通过测定荧光强度确定待检抗原或抗体的含量。常用碱性磷酸酶ALP标记。,荧光免疫技术的应用,1、自身抗体检测；,2、病原体检测；,3、免疫病理检测；,4、细胞表面抗原和受体检测。,吉普塞舞神,第九章 酶免疫技术,酶免疫技术：在酶标抗体（抗原）及抗原（抗体）的特异性反应完成后，加入酶的相应底物，通过酶对底物的显色反应，对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析。,常用酶及其底物,1、辣根过氧化物酶（HRP）：由无色的糖蛋白（主酶）和亚铁血红素（辅基）结合而成的复合物。辅基是酶活性基团。,底物：邻苯二胺（OPD）、四甲基联苯胺（TMB）应用广泛,2、碱性磷酸酶（AP）,底物：对硝基苯磷脂酸（p-NPP）,3、-半乳糖苷酶（-Gal）：因人血中缺乏此酶，以其制备的酶标志物在测定时不易受到内源性酶的干扰，从而提高特异性，被用于均相酶免疫测定中。,底物：4-MUU,吉普塞舞神,第九章 酶免疫技术,酶免疫技术：,1、酶免疫测定（EIA）：用于液体标本中抗原或抗体的定性和定量。,2、酶免疫组织化学技术：用于组织切片或其他标本中抗原的定位。,均相酶免疫测定,利用酶标志物及相应的抗原或抗体结合后，标记酶的活性会发生改变的原理，可以在不将结合和游离酶标志物分离的情况下，通过测定标记酶的活性的改变而确定抗原或抗体的含量。,异象酶免疫测定,是目前应用最广泛的一类，分为液相和固相酶免疫测定两类。,如ELISA。,吉普塞舞神,第九章 酶免疫技术,ELISA,三个必要的试剂：固相的抗原或抗体；酶标记的抗原或抗体；,酶反应的底物。,抗原测定：,双抗体夹心法：常用。,双位点一步法：针对抗原上的两个不同的抗原决定簇的两种抗体，一个用来包被，一个用来酶标记。当抗原过量时可分别结合固相抗体和酶标记抗体，出现钩状效应。,竞争法：针对只有单个抗原决定簇的小分子。,抗体测定：,间接法：固相抗原-待测抗体-酶标抗抗体复合物。,双抗原夹心法,竞争法：多用于乙型肝炎病毒核心抗体（HBcAb）和乙型肝炎病毒e抗体（HBeAb）的检测。,捕获法：又称反向间接法，常用病原体急性感染诊断中的IgM抗体。,应用：ELISA可用于病毒（甲肝、乙肝两对半等）风疹、疱疹、轮状病毒等；细菌如结核、HP等，也用于各种免疫球蛋白、补体、肿瘤标志物等。,吉普塞舞神,第十章 化学发光免疫分析技术,直接化学发光剂：1、吖啶酯；2、三联吡啶钌,酶促反应发光剂：标记酶有HRP和碱性磷酸酶；,HRP催化的发光剂为鲁米诺及其衍生物；,AP催化的发光底物为AMPPO。,吉普塞舞神,第十一章 生物素-亲和素放大技术,生物素（biotin，B）、亲和素（avidin，A）,生物素-亲和素系统（BAS）是一种以生物素和亲和素具有的多级放大结合特性为基础的实验技术，既能偶联抗原抗体等大分子生物活性物质，又可被荧光素、酶、放射性核素等材料标记。,生物素：可以标记蛋白质氨基、醛基、巯基和核酸。,亲和素（AV）和链霉亲和素（SA）是生物素的天然特异性结合物。,1个AV和SA能结合4个生物素分子，因此具有放大效应。,吉普塞舞神,第十一章 生物素-亲和素放大技术,BAS的应用,1、BAB法：也称侨联亲和素-标记生物素法（BRAB），以游离的亲和素,作为侨联剂，利用亲和素的多价性，将检测体系中的抗原-生,物素化抗体复合物及标记生物素连接起来。,抗原-生物素+亲和素+生物素-标记,2、ABC法：预先按一定比例将亲和素及酶标生物素结合，当其及反应体,系中的生物素化抗体相遇时，ABC中未饱和的亲和素结合部位,即可及抗体上的生物素结合。,抗体-生物素+亲和素-生物素-酶标复合物,3、BA法：也叫LAB法，以标记亲和素直接及免疫复合物中的生物素化抗,体连接进行检测。,酶标记-亲和素+生物素-抗体,BAS用于荧光抗体技术，通常用BA法，用荧光素直接标记亲和素。,吉普塞舞神,第十二章 固相膜免疫测定,以微孔膜作为固相，固相膜的特点：多孔性、高度吸附抗体或抗原、易于漂洗，可被液体穿过流出，液体也可通过毛细管作用在膜上向前移行。,标记物可用酶、彩色乳胶、胶体金、胶体硒等。,常用固相膜：玻璃纤维素膜、尼龙膜、聚偏氟乙烯（PVDF）膜和,硝酸纤维素（NC）膜，最长用NC膜,免疫金标记技术：标志物在配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测。,免疫渗滤实验（IFA）用于检测各种传染病的抗体和肿瘤标志物等。用以检测尿液HCG的“金标”早孕诊断试剂也已广泛使用。,结果：膜中央有清晰的淡红色或红色斑点为阳性，反之阴性。,免疫层析实验（ICA）：常用胶体金，称为金免疫层析实验（GICA）,及IFA的不同在于液体的移动不是直向穿流，而是基于层析作用的横流。,结果：阴性为一条棕红线条带；阳性为两条，无条带为试剂失效。,吉普塞舞神,第十二章 固相膜免疫测定,斑点酶免疫吸附实验（Do-ELISA）：及ELISA不同之处在于载体为蛋白质、NC膜，没作用于底物后形成有色的沉淀物，使NC膜染色。,结果：阳性者在膜上出现肉眼可见的染色斑点，灵敏度比ELISA高。,酶联免疫斑点实验（ELISPOT）：体外检测特异性抗体分泌B细胞和细胞因子分泌T细胞。检测活细胞。,结果：阳性PVDF膜出现紫色斑点。1个斑点代表一个细胞，灵敏度高。,应用非常广泛：,如移植中排斥反应的预测，疫苗发展、Th1/Th2分析、自身免疫性疾病研究、肿瘤研究、过敏性疾病研究、感染性疾病研究、抗原决定簇图谱分析、化合物和药物免疫学反应的筛选。,免疫印迹法（Western Blot）：常用多克隆抗体。,吉普塞舞神,第十三章 免疫组织化学技术,标本：,1、活体组织：应取材于病变组织及病变及正常组织交织处。,2、各种体液、穿刺液：直接涂片或经离心涂片。,3、培养细胞：单层细胞直接固定。,固定剂：10%福尔马林,制片方法,1、冰冻切片：使抗原得到最大限度保存，但形态保存不佳,2、石蜡切片：研究形态学的主要制片方法,常用抗原暴露方法：微波法、高压锅法,标本的保存：最好直接镜检，4干燥可保存1个月。,但病毒和某些组织抗原标本抗原性丧失很快，需-20下保存。,吉普塞舞神,第十三章 免疫组织化学技术,酶免疫组织化学技术的优点（及荧光免疫技术相比）：,可长期保存、可用普通光镜观察、可观察组织细胞的细微结构、敏感度高。,1、直接法：将酶标记在特异抗体上，直接及组织内抗原反应。,2、间接法：将酶标记在二抗上，先将一抗及相应的组织抗原结合，,再连接二抗。应用广泛。,免疫组化中常用的酶及显色底物,1、HRP：底物为二氨基联苯胺（DAB），反应产物呈棕色。,2、氨基乙基卡巴唑（AEC）：反应产物呈橘红色。,3、4-氯-1-萘酚：产物灰蓝色。,广义的亲和组织化学染色包括：,抗原及抗体；植物凝集素及糖类；生物素及亲和素；SPA及IgG；,阳离子及阴离子；配体及受体。,吉普塞舞神,第十四章 免疫细胞的分离及其表面标志检测技术,外周血单个核细胞的分离,密度梯度离心,2份6%聚蔗糖蒸馏水+1份34%泛影葡胺生理盐水，比重为1.0770.002；,作为淋巴细胞分离液，即Ficoll液。,上到下依次为：稀释的血浆层、单个核细胞层、粒细胞层和红细胞层。,淋巴细胞的分离,利用单核细胞在37和Ca2+存在时，能主动黏附在玻璃、塑料等材料上的特性，从单个核细胞悬液中去除单核细胞，从而获得淋巴细胞。也可用Percoll分离液法。,分离细胞的保存,1、短期保存：将细胞用含10%20%灭活小牛血清的培养液稀释重悬，,4保存。,2、长期保存：液氮，加DMSO。,活力测定：台盼蓝蓝色，活细胞不着色，死细胞呈蓝色。,吉普塞舞神,第十四章 免疫细胞的分离及其表面标志检测技术,淋巴细胞表面标志及亚群分类,一、T细胞表面标志及其亚群,T细胞共同的标志抗原：CD3,辅助性T细胞（Th）：CD3+CD4+CD8-；,细胞毒性T细胞（Tc/CTL）：CD3+CD4-CD8+；,调节性T细胞（Tr/Treg）：CD4+CD25+。,CD2：表达于全部人T细胞和NK细胞，因能及绵阳红细胞（SRBC）,结合，又称绵羊红细胞受体。,CD3：表达于全部T细胞表面，是TCR-CD3复合物的重要组成部分。,CD4/CD8：表达CD4的主要是辅助性T细胞、表达CD8的主要是细胞,毒性T细胞。,其他表面标志：致有丝分裂受体,辅助性T细胞分为：Th1、Th2,Th1主要分泌IL-2、IFN-或TNF-等细胞因子辅助细胞免疫或参及迟发型超敏反应，本身具有明显的细胞毒作用。,Th2主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等细胞因子辅助体液免疫，参及速发型超敏反应，但本身不具有明显的细胞毒作用。,细胞毒性T细胞分为：Tc1、Tc2都有典型的细胞毒作用。,吉普塞舞神,第十四章 免疫细胞的分离及其表面标志检测技术,淋巴细胞表面标志及亚群分类,二、B细胞表面标志,B细胞的重要表面标志：膜免疫球蛋白（SmIg）、Fc受体、补体受体、EB病毒受体、小鼠红细胞受体。,SmIg为B细胞特有，是鉴定B细胞的可靠指标。,SmIg又称BCR，mIg的主要作用是结合特异性抗原，故又称抗原受体。成熟的B细胞的mIg主要为mIgM和mIgD。,B细胞的表面特异CD分子有CD19、CD20、CD21、CD22和CD23等。,B细胞及其亚群的检测是研究自身免疫性疾病及疾病中免疫调节紊乱的重要指标。,三、NK细胞表面标志,NK细胞典型标志：CD3-CD16+CD56+,CD16分子又称为低亲和性IgG Fc受体，行使针对靶细胞的定向非特异性杀伤作用，也即NK细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用（ADCC）。,吉普塞舞神,第十四章 免疫细胞的分离及其表面标志检测技术,其他免疫细胞,抗原递呈细胞（APC）,“专职”抗原递呈细胞，包括巨噬细胞、树突状细胞和B细胞，它们均可表达MHC-类分子；,“非专职”抗原递呈细胞，包括内皮细胞、上皮细胞和激活T细胞等。,单核-吞噬细胞系统（MPS）典型表面标志是CD14。,DC细胞的主要特征表面标志是CD1a、CD11c和CD83。,免疫细胞表面标志的检测方法：,1、抗体致敏花环法,2、免疫细胞化学法,3、免疫荧光法,4、流式细胞分析法,CD4/CD8比值升高常见于自身免疫性疾病；而CD4/CD8比值降低常见于病毒感染、恶性肿瘤和再障等。,吉普塞舞神,第十五章 免疫细胞功能检测技术,一、淋巴细胞的功能检测,体内试验：主要是进行迟发型超敏反应，借此间接了解淋巴细胞对,抗原、半抗原或有丝分裂原的应答反应；,体外试验：主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂原刺激后的增值反,应、细胞毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定。,（一）T细胞功能试验,1、T细胞增殖试验,体外刺激物：植物血凝素（PHA）、刀豆素A、白喉类毒素、破伤,风类毒素、白色念珠菌等。,2、T细胞分泌功能测定,分别检测细胞因子的含量、生物活性和基因表达水平。,3、T细胞介导的细胞毒试验,适当的靶细胞（肿瘤细胞）及待检淋巴细胞共培养，观察肿瘤细胞杀伤情况。,4、体内试验,正常机体对某种特殊抗原建立了细胞免疫后，如用相同抗原做皮肤试验，常可出现阳性的迟发型超敏反应。目前临床上用来诊断某些病原生物感染（结核、麻风等）和细胞免疫缺陷等疾病。,结核菌素皮肤试验；PHA皮肤试验用于检测机体的细胞免疫水平。,吉普塞舞神,第十五章 免疫细胞功能检测技术,（二）B细胞功能检测,1、B细胞增殖试验：小鼠B细胞用LPS刺激；,人B细胞用含SPA的金黄色葡萄球菌及抗IgM抗体刺激。,2、溶血空斑试验：,经典溶血空斑试验：检测动物抗体形成细胞的功能。,被动溶血空斑试验：人抗体形成细胞产生的Ig及SRBC上的抗原结合，,在补体作用下出现溶血反应。,3、酶联免疫斑点实验（ELISPOT）,既可检测抗体分泌细胞，又可检测抗体分泌量。,4、体内试验,常用白喉毒素、破伤风毒素、多价肺炎链球菌菌苗等，将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并及免疫前后分别采血，测定受试者相应抗体效价，判断B细胞功能。,（三）NK细胞活性测定,NK细胞及肿瘤细胞共同培养，观察肿瘤细胞的存活情况。,测定人NK细胞常用K562细胞株；,测定小鼠NK细胞活性常用YAC-1细胞株。,吉普塞舞神,第十五章 免疫细胞功能检测技术,二、吞噬细胞功能检测技术,（一）中性粒细胞功能检测,1、趋化功能检测,Boyden小室法、琼脂糖平板法,2、吞噬和杀菌功能测定,显微镜检查法、溶菌法、NBT还原实验,（二）巨噬细胞功能检测,1、炭粒廓清试验,2、吞噬功能检测,3、巨噬细胞溶酶体酶的测定,4、细胞毒作用测定,5、巨噬细胞促凝血活性测定,吉普塞舞神,第十六章 细胞因子及细胞黏附因子的测定,细胞因子的本质是蛋白质或多肽；黏附分子的本质是糖蛋白。,常见的测定方法：分子生物学测定基因或mRNA；,生物活性测定；,生物活性测定法,1、促进细胞增殖和抑制细胞增殖测定法,常用放射性核素掺入法和MTT比色法,2、细胞毒活性测定法,对指示细胞具有破坏作用的细胞因子，会导致细胞死亡，检测细胞死亡数作为检测指标，本法常用作TNF等测定。,3、抗病毒活性测定,用于IFN等细胞因子的检测。,4、趋化活性测定法,趋化因子诱导中性粒细胞、单核-巨噬细胞或淋巴细胞等定向迁移，其诱导迁移的方式包括趋化性和化学增活性。,趋化性：诱导细胞由趋化因子低浓度处向趋化因子高浓度处定向移,动的特性。采用Boyden小室趋化试验测定。,化学增活性：指细胞因子增强细胞随机运动的能力，采用琼脂糖小,滴化学动力学试验测定。,吉普塞舞神,第十六章 细胞因子及细胞黏附因子的测定,免疫测定方法,1、ELISA法：测定细胞因子和可溶性黏附分子。,2、流式细胞分析：主要检测细胞内细胞因子和细胞表面黏附分子。,3、酶联免疫斑点试验（ELISPOT）：,用于类风湿因子、IFN-等细胞因子分泌细胞的定量测定。,吉普塞舞神,第十七章 流式细胞仪分析技术及应用,FCM常用染料有：,异硫氰酸荧光素（FITC）、藻红蛋白类（PE）、罗丹明,AID检测中的应用,T淋巴细胞总数减少、T细胞亚群CD4Th/CD8Tc比例倒置，Th/Tc1，,Th细胞数量显著下降，Tc细胞正常，NK细胞减少或活力下降，B淋巴细胞处于正常范围。,自身免疫性疾病相关HLA抗原分析,强直性脊柱炎：外周血HLA-B27的表达及表达程度及疾病发生有很,高的相关性。,吉普塞舞神,第十八章 体液免疫球蛋白测定,一、血清IgG、IgA、IgM测定,IgG：血清中含量最高的免疫球蛋白，其中IgG1最多、IgG4最少。,是血液和细胞外液中的主要抗体，也是机体再次免疫应答的,主要抗体，大多数抗感染抗体及自身抗体都是IgG。,IgA：血清型主要以单体形式存在；,分泌型由J链连接的二聚体和分泌成分组成。,是参及黏膜局部免疫的主要抗体，分布于胃肠道和支气管分,泌液、初乳、唾液和泪液中。,IgM：五聚体、分子量最大，又称巨球蛋白，主要存在于血液中。,是个体发育中最早合成和分泌的抗体，也是抗原诱导的体,液免疫中最早出现的抗体。,测定方法：单向环状免疫扩散法、免疫比浊法。,临床意义：,1、IgG分子量小、可透过胎盘，故新生儿血液中IgG含量接近成人。,2、3中Ig均升高：见于慢性肝脏疾病。,3、IgG升高：见于慢性细菌性感染，如慢性支气管炎、肺结核。,4、IgM升高：宫内感染、类风湿性关节炎。,5、SLE（系统性红斑狼疮）：IgG、IgA升高。,吉普塞舞神,一、血清IgG、IgA、IgM测定,单一免疫球蛋白升高：,指患者血清中某一类免疫球蛋白显著增多，大多在30g/L以上，称为单克隆蛋白（MP），也叫M蛋白。此类异常增多的免疫球蛋白多无免疫活性，又称副蛋白。,见于免疫增殖病，如多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、恶性淋巴瘤、,重链病、轻链病等。,免疫球蛋白降低：,先天性：见于体液免疫缺陷病和联合免疫缺陷病。,获得性：IgA缺乏，易发生反复呼吸道感染；,IgG缺乏，易发生化脓性感染；,IgM缺乏，易发生革兰氏阴性菌败血症。,第十八章 体液免疫球蛋白测定,吉普塞舞神,第十八章 体液免疫球蛋白测定,二、血清IgD和IgE测定,IgD：膜结合型IgD（mIgD）构成B细胞BCR，是B细胞成熟的标志。,未成熟B细胞仅表达mIgM，成熟B细胞同时表达两种。,活化的B细胞或记忆B细胞mIgD逐渐消失。,IgE：含量最少，主要由黏膜下淋巴组织中的浆细胞分泌。,IgE为亲细胞抗体，可诱发型超敏反应，也和抗寄生虫有关。,检测方法：ELISA,三、尿液及脑脊液Ig测定,1、尿液中Ig测定,正常人尿液中Ig含量极微，肾小球滤过膜损伤轻微时，尿液中IgG滤出增多；滤过膜损伤严重时，分子量较大的IgM也开始滤出。,临床常选用测定尿液和血液中转铁蛋白（TRF）和IgG含量，计算选择性蛋白尿指数（SPI），评估肾小球滤过膜的受损程度。,SPI0.1：见于微小病变型肾病；,SPI0.2：见于膜性肾病、膜增殖性肾炎及肾病综合征。,吉普塞舞神,第十八章 体液免疫球蛋白测定,三、尿液及脑脊液Ig测定,2、脑脊液Ig测定,临床上通过测定白蛋白商值（QALB），即测定CSF（脑脊液）中白蛋白和血清白蛋白比值来反应血脑屏障受损程度。,商值9，血脑屏障无受损；915，轻度受损；1533，中度受损；,33100，重度受损；100，完全破裂。,QALB轻度升高，见于急慢性病毒感染；,QALB中度升高，见于急性神经疏螺旋体病；,QALB重度升高，见于化脓性脑膜炎、结核性脑膜炎等细菌性感染。,脑脊液IgG测定采用速率散射免疫比浊法，脑脊液采集后应离心再,测定。,四、M蛋白测定及临床意义,1、血清蛋白区带电泳技术：筛选M蛋白的经典方法。,2、血清免疫球蛋白定量测定：包括单向免疫扩散和比浊法，是检,测M蛋白的初筛试验。,3、免疫电泳：鉴定M蛋白的常规方法。,4、免疫固定电泳：临床鉴定M蛋白最常用的方法。,利用区带电泳和特异性抗血清的免疫沉淀反应。,吉普塞舞神,第十八章 体液免疫球蛋白测定,五、轻链测定及其临床意义,1、本-周蛋白测定,方法：化学法（加热沉淀法）和免疫法,检测本-周蛋白是对轻链病的诊断必不可少的项目。,轻链病患者尿中可测得本-周蛋白，血中反而阴性，因为分子量小，极易从肾脏排出。,2、-Ig和-Ig定量测定,方法：单向免疫扩散法和免疫比浊法。,六、冷球蛋白的测定,冷球蛋白又称冷免疫球蛋白，一般在-4发生沉淀，37复溶。,型：单克隆冷球蛋白，常见IgG、IgM、IgA，多见于免疫增生,性疾病，如多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症。,型，单克隆混合型冷球蛋白，最常见的组合为IgM-IgG。多见,于自身免疫性疾病，如类风湿关节炎。,型，多克隆混合型冷球蛋白，多见于传染性单核细胞增多症、,病毒性肝炎、链球菌感染等感染性疾病。,检测冷球蛋白宜在体温条件下采集和保存静脉血。,吉普塞舞神,第十九章 补体检测及应用,补体总活性测定,以红细胞的溶解为指示，以50%溶血为判断终点，故称CH50。,通常CH50指基于经典途径的CP-CH50。（classic pathway）,原理：补体最重要的活性是溶细胞作用，特异性抗体及红细胞结合后可激活补体，导致红细胞表面形成跨膜小孔，使胞外水分渗入，引起红细胞肿胀破裂。溶血反应对补体的剂量依赖呈S型曲线，实验常以50%溶血为终点指标，比100%溶血更为敏感，因此称为补体50%溶血试验（CH50）。,该法主要检测的是补体经典途径的溶血活性，所得结果反应补体C1C9等9种成分的综合水平。如CH50测定值过低或完全无活性，应考虑补体缺陷，检测补体单个成分。,临床意义：,血清补体水平下降：,肝病或营养不良引起的蛋白质合成不足；,SLE、类风湿关节炎、强直性脊柱炎等自身免疫病活动期消耗补体。,细菌感染，旁路途径活化消耗补体。,血清补体水平升高：,心肌梗死、甲状腺炎、大叶性肺炎、糖尿病、妊娠等。,吉普塞舞神,第十九章 补体检测及应用,单个补体成分测定,检测指标：C3、C4、C1q、B因子、C1酯酶抑制物等,1、免疫溶血法,指示系统：抗原为SRBC，抗体为抗SRBC的抗体，即溶血素。,检测补体的活性。,2、免疫化学法,待测血清中的C3、C4及相应抗体结合，反应介质中的PEG可使该复合物沉淀。,检测补体的含量。,吉普塞舞神,第十九章 补体检测及应用,补体结合实验（CFT）,利用补体的溶细胞作用检测各种物理状态的抗原抗体测定。,实验原理：1、反应系统：已知抗原（抗体）及待测抗体（抗原）；,2、补体系统：多采用豚鼠血清；,3、指示系统：致敏绵阳红细胞。,第一步：反应系统及补体作用；,第二步：指示系统利用剩余补体作用。,结果：不溶血为补体结合实验阳性；溶血为实验阴性。,试验中以50%不溶血作为判断终点。,补体测定的应用,1、诊断梅毒螺旋体感染的华氏反应；,2、HLA分型的补体依赖性细胞毒试验；,3、抗体形成细胞定量检测的溶血空斑技术。,吉普塞舞神,第二十二章 感染性疾病及感染免疫检测,感染性疾病的早期诊断：病原体抗原和宿主抗血清。,IgM抗体出现早，消失快，常作为感染的早期诊断指标；,IgG类抗体出现晚，维持时间长，是流行病学调查的重要依据。,一、细菌感染性疾病的免疫检测,抗细胞内感染：主要是细胞免疫；,抗细胞外细菌感染：主要是B细胞介导的体液免疫。,（一）链球菌感染,1、链球菌,最常用的免疫学检查是抗链球菌溶血素“O”（ASO）检测。,ASO增高常见于急性咽炎等上呼吸道感染、风湿性心肌炎、心包炎、风湿性关节炎和急性肾小球肾炎。,2、猪链球菌,实验室检查有细菌培养、鉴定和免疫学检查。以及分子诊断技术。,吉普塞舞神,一、细菌感染性疾病的免疫检测,（二）伤寒沙门菌感染,沙门菌可致多种感染，轻者为自愈性肠胃炎，重者可引起致死性伤寒。,伤寒沙门菌的实验室诊断主要依赖于免疫学检测方法。,1、肥达反应：血清凝集试验,伤寒沙门菌有菌体O抗原、鞭毛H抗原和表面Vi抗原，三者的抗体均为非保护性抗体。由于O抗原和H抗原的抗原性较强，常用作血清凝集试验。,2、ELISA：以伤寒沙门菌脂多糖成分为抗原，检测伤寒患者血清,中的特异IgM成分。,（三）结核分枝杆菌感染,结核分枝杆菌（TB）进入人体后，可以诱导机体产生抗感染的细胞免疫，也能产生抗结核分枝杆菌的抗体反应。,1、结核菌素试验：包括针对旧结核菌素（OT）及结核菌素纯蛋,白衍生物（PPD）两种菌体蛋白。,2、分枝杆菌抗体检测：胶体金法。,3、全血干扰素测定：鉴定菌种。,第二十二章 感染性疾病及感染免疫检测,吉普塞舞神,第二十二章 感染性疾病及感染免疫检测,二、真菌感染性疾病的免疫检测,临床上将真菌分为：浅部真菌和深部真菌,临床上的HIV患者、放化疗肿瘤患者、长期使用糖皮质激素的患者以及使用免疫抑制剂的受移植者中真菌感染显著增加。,（一）深部真菌感染,1、念珠菌感染；2、隐球菌感染；3、曲霉感染；,深部真菌感染缺乏特意症状和体征，取材困难，多采用免疫血清法。,（二）类真菌感染,卡式肺孢子菌，又称卡氏肺孢子虫。,多依赖形态学检查，呼吸道分泌物或肺活检组织切片染色见肺泡内泡沫状嗜伊红物质中富含本病原体。,三、病毒感染性疾病的免疫检测,（一）流感病毒感染,1、病毒抗原检测：早期诊断,2、抗体检测：血凝抑制试验或补体结合实验,3、禽流感病毒：A型禽流感病毒（AIV）针对特异性抗体检测。,（二）轮状病毒感染,人轮状病毒（HRV）引起肠炎和腹泻，主要检测抗原和抗体。,吉普塞舞神,第二十二章 感染性疾病及感染免疫检测,三、病毒感染性疾病的免疫检测,（三）肝炎病毒感染,1、甲肝HAV：ELISA或化学发光检测IgM或IgG。,2、乙型肝炎病毒（HBV）,乙型肝炎表面抗原（HBsAg）：早期诊断的重要指标。,乙型肝炎病毒表面抗体（抗-HBs）：阳性提示感染后的康复；,HBV疫苗接种者血中是否能检出抗-HBs，是衡量预防接种效果的最重要指标。,HBsAg含量消失同时伴抗-HBs的出现，是临床上慢性乙肝治疗的最终目标。,乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）：乙型肝炎传染性的标志。,乙型肝炎病毒e抗体（抗-HBe）：多出现于急性肝炎恢复期。,HBeAg含量消失同时伴抗-HBe的出现，是目前临床上慢性乙型肝炎治疗的近期目标。,乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）：是乙型肝炎病毒存在的直接标志，及HBV的复制正相关，可反映HBV的活动性及复制程度。,乙型肝炎病毒核心抗体-IgM（抗-HBc-IgM）,早期HBV感染的特异性血清学标志，有助于区分慢性活动性和非活动性肝炎。,吉普塞舞神,第二十二章 感染性疾病及感染免疫检测,三、病毒感染性疾病的免疫检测,2、乙型肝炎病毒（HBV）,乙型肝炎病毒核心抗体-IgG（抗-HBc-IgG）,乙型肝炎病毒前S1抗原（pre-S1）：,HBV外膜蛋白，在病毒入侵肝细胞中发挥作用。,乙型肝炎病毒前S2抗原（Pre-S2）：,及HBV的感染和复制有密切关系。,3、丙型肝炎病毒感染（HCV）,针对特异性抗体HCV-IgG和HCV-IgM的免疫学检测,4、丁型肝炎病毒感染（HDV）,目前检查主要针对HDVAg、抗HDV总抗体、IgM、IgG。,5、戊型肝炎病毒感染（HEV）,HEV感染为自限性，一般无慢性化过程，也无慢性HEV携带者。,实验室免疫学检查针对HEV-Ag、HEV-IgM、HEV-IgG。,（四）冠状病毒感染,SARS的检查主要针对血清中的IgM抗体，抗体效价4倍增长提示近期感染。,吉普塞舞神,第二十二章 感染性疾病及感染免疫检测,四、先天性感染的免疫检测,产前检查4项“TORCH”：,弓形虫（TOC）、巨细胞病毒（HCMV）、风疹病毒（RUV）、,单纯疱疹病毒（HSV）。,胎儿在母体内受到感染可导致流产、死胎、胎儿畸形、或出现婴儿智力低下、视听障碍等。,五、寄生虫感染的免疫检测,1、疟原虫感染,疟原虫寄生于人体红细胞和肝细胞，引起疟疾。寄生于人体的疟原虫有间日疟原虫、恶性疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫四种。,抗体检测：间接荧光抗体实验。,2、血吸虫感染：环卵沉淀反应（COPT）：是一种抗原抗体反应。,3、丝虫感染：ELISA检测丝虫抗体。,4、华支睾吸虫感染,华支睾