七肿瘤侵袭转移及干预研究

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,Cancer,Invasion,&,Metastasis,Liver Metastasis of Lung Cancer,主要内容,一、概述,二、侵袭、转移的定义,三、癌转移的条件及特点,四、肿瘤转移过程,五、肿瘤转移的分子机制,什么是转移？,肿瘤侵袭（Invasion),是指恶性肿瘤细胞离开原发灶而侵犯邻近组织并继续增殖的过程。,肿瘤细胞的增殖,肿瘤从原发灶脱离E-钙粘连素下降,肿瘤细胞的运动性和趋化性,血管生成与肿瘤侵袭,侵袭包括四个过程,肿瘤细胞的增殖,Ki67是一种增殖相关核抗原，检测其表达能特异性识别增殖的肿瘤或正常细胞。反映细胞增殖活性的Ki 67指数(Ki67 LI)可作为判断肿瘤生长速度的指标。研究发现，传统的反映肿瘤侵袭能,力的形态学标志(如核多形性、细胞不典型性和有丝,分裂活跃等)，与垂体腺瘤增殖和侵袭性相关性较低。,而肿瘤生长速度则被认为是反映垂体腺瘤侵袭性的,客观指标,这与其具有高增殖性及高侵袭性有关。本实验应用腺病,毒作为载体介导抑癌基因PTEN体外转染人脑胶质瘤细,胞U87，检测其细胞增殖力与体外侵袭力的改变，进而探,讨PTEN作为胶质瘤基因治疗靶点的可能性。,是恶性肿瘤细胞脱离原发部位，通过各种渠道转运到不连续的靶组织中继续增殖，形成同样性质肿瘤的过程。,远隔部位继发瘤形成,继发瘤继续生长,继发瘤再侵袭转移,肿瘤转移(Metastasis),人类对肿瘤侵袭转移的认识,肿瘤是高度异质性的细胞群体,转移是一个多步骤、序贯的复杂过程,转移的发生是多因素相互作用的结果,（Fidler,IJ,Surgical Oncology Clinics of North America. 2001，10（2）：257-269）,转移有什么特点？,肿瘤转移特点,1. 不同肿瘤其转移能力有差异,低转移,基底细胞癌、脊髓瘤、 唾液腺腺样囊性癌、软骨肉瘤、,高转移,甲状腺滤泡型腺癌、黑色素瘤,2. 不同类型肿瘤其转移途径不同,淋巴道转移 癌 如肺癌、,NPC,血道转移 肉瘤、绒癌、肾癌,前列腺癌等,3. 转移的器官特异性,原发瘤,转移器官,乳腺癌,骨、脑、肾上腺,前列腺癌,骨,肺小细胞癌,骨、脑、肝,甲状腺癌,骨,肾癌,骨、肝、甲状腺,膀胱癌,脑,睾丸癌,肝, ,“,Seed and Soil,” theory,By Paget S.,The distribution of secondary,growth in cancer of the breast,Lancet, 1889,Seed:,tumor cell with metastatic,potential,Soil:,microenviroment,转移器官特异性的机制,(1) 肿瘤细胞表型的差异,-异质性,表现,细胞表面糖蛋白复合物、抗原、,酶活性、运动能力等,如 EGFR(-)/EGFR(+),HEx20,EBERx20,TFCx20,HEx20,EBERx20,TFCx20,NPC65,HEx60,EBERx60,TFCx60,NPC65,（2）组织器官微环境差异,实验证明,不同肿瘤移植于相同器官,同种肿瘤移植于不同器官,侵袭转移能力有差异,如：部位相同 小鼠胃癌、人食管癌,不同部位 皮下、肌肉和腹腔,继发器官微环境对肿瘤细胞的特殊亲和性, 继发器官脉管内皮细胞,及细胞外基质结构, 化学趋化因子作用, 器官相关的免疫状态, 各种生长因子作用,鼻咽癌转移,裸鼠模型,肿瘤发生转移,需要哪些条件？,三、肿瘤细胞发生转移的条件及转移特点,（一）转移发生的条件,1.细胞变异转移异质性,瘤细胞遗传不稳定,异质性演进,转移亚克隆优势生长,依据,转移异质性实验依据1977 Fidler,Clone,Tissue culture,Spontanous,metastasis,Nine times,CNE-2Z-H5,本实验室进行裸鼠体内筛选高转移癌株：,BALB/c nude mice,2. 微环境和机体免疫状态,（1）毗邻细胞,旁分泌各种生长因子，,促进肿瘤生长,（2）血液流变学改变,表现 血浆粘稠度及,红细胞密度高,（3）机体的免疫反应,（4）细胞粘附性改变,瘤细胞瘤细胞间粘附力下降,瘤细胞细胞外基质(ECM)粘,附力增高,肿瘤转移的条件,四、肿瘤转移过程及其影响因素,Fidler,（一）原发瘤的形成与生长,即正常细胞的转化和生长,受血管生成因子和抑制因子,共同调控,（二）肿瘤血管生成,始于肿瘤直径达1-2mm,与宿主血管网互相联系,（三）肿瘤细胞脱落并侵入基质,1.,瘤细胞 粘附能力改变,同质型粘附力低,异质性粘附力高,易侵袭转移,细胞粘附力与转移关系,细胞系,同质粘附%,转移率%,LA1 91.29 0,LAD 88.5 16,LA5 72.5 32,CNE2L4 63 13,CNE2L2 92 100,异质粘附%,瘤细胞间桥粒减少,瘤细胞表面负电荷增加,钙粘蛋白,表达水平下降,瘤细胞表面受体改变,瘤细胞表面纤维连接蛋白减少,有关影响因素,2. 瘤细胞表面负电荷增加,实验表明：,细胞系,电泳率,转移率%,CNE2L4 0.76 m/sec/v/cm 13,CNE2L2 1.36 m/sec/v/cm 100,3. 瘤细胞运动能力增强,细胞系,36h,(m/h),转移率%,LA1 198 0,LAD 285 16,LA5 316 32,CNE2L4 16.94 13,CNE2L2 28.94 100,刺激瘤细胞运动而抑制其生长，如TGF,干扰素等,参与调控肿瘤细胞运动的因子,促进瘤细胞运动与生长，如,EGF,肝细胞生长因子等,刺激肿瘤细胞运动和侵袭的因子，,如：自分泌运动因子(AMF),4. 瘤细胞产生蛋白水解酶增加,主要包括,血浆纤维蛋白溶解酶原激活物,（Plasminogen activators,PA),组织蛋白酶,(cathepsins),基质金属蛋白酶,(Matrix metalloproteinase,MMPs）,（四）瘤细胞进入脉管系统,新生脉管管壁不完整,瘤细胞通过运动、粘附、侵袭血管基底膜而进入脉管,（五）瘤细胞与脉管粘附及瘤栓形成,循环中的瘤细胞互相粘连或与血小板粘附形成瘤栓。,瘤细胞通过粘附分子介导与内皮细胞粘附（选择素、整合素及其受体等）,但瘤细胞与内皮细胞粘附有异质性,（六）瘤细胞穿出血管,内皮细胞,层损伤,内皮下基,底膜暴露,瘤细胞,粘附,降 解,基底膜,瘤细胞,运动进,入间质,（七）转移灶生长及再侵袭转移,瘤细胞与靶器官的实质细胞粘附,瘤细胞和靶器官分泌各种生长因子刺激瘤细胞增殖,新生血管形成,微小转移的概念,1971年 Huvos 直径2,1980年 Black直径小于受累淋巴结的20%作为标准,1993年国际抗癌联盟(UICC)12,目前, 直径0.05) VEGF165 2.050.03(,P,0.01) VEGF145 2.730.15(,P,0.05) VEGF121 1.650.01(,P,0.05) VEGF165 2.050.03(,P,0.01) VEGF145 2.730.15(,P,0.05) VEGF121 1.650.01(,P,0.05),低氧诱导VEGF 蛋白表达 (Western-Blot),VEGF in hypoxic cells was (2.200.07)-fold of that in normoxic cells.,（四）蛋白水解酶与肿瘤转移,1. 纤维蛋白溶解酶原激活剂及其抑制剂(PA and PAI),(1) PA的分类与功能,分组织型,(t-PA),和尿激酶型,(u-PA),为不同的基因产物，结构相似，单链丝氨酸蛋白酶。,参与肿瘤侵袭转移过程，包括细胞分化、血管生成、细胞迁移、基质降解等。,l,uPAmRNA,246bp,M,CNE,-,2Z,CNE,-,2Z,-,H5,CNE,-,2Z,-,H5,-,9,图1 uPA在鼻咽癌细胞中的表达,图2 各鼻咽癌细胞RT-PCR结果uPA mRNA与GAPDH mRNA灰度比值,包括,PAI-1,2,3, PAI-1,为糖蛋白,，52KD,PAI-2,分子量,46.6KD,为,u-PA,抑制剂,在多数肿瘤中高表达，提示,预后好。,(2) PAI的分类与功能,图5 PAI-1 mRNA在鼻咽癌细胞中的表达,图6 各鼻咽癌细胞RT-PCR结果PAI-1 mRNA与GAPDHmRNA灰度比值,(1) 分类与结构,为Zn,依赖的内肽酶，包括,胶原酶(collagenase),明胶酶(gelatinase),基质溶素(tromitysinase),膜型MMP(MT-MMPs),2. 基质金属蛋白酶及其抑制剂,( MMPs/TIMPs),能降解ECM中所有成份,。,诱导和促进新生血管形成。,调节瘤细胞的粘附。,免疫组化检测鼻咽癌组织中MMP-2,MMP-9,LMP-1的表达情况,慢性鼻咽炎,鼻咽癌,淋巴结转移癌,MMP-2,MMP-9,（五） 机体免疫与转移,（1） NK细胞,为第一道防线，无需抗原刺激 可杀伤瘤细胞。,实验依据：,1、参与控制转移的免疫细胞,清除,NK,细胞,小鼠,环磷酰胺,移植肿瘤于小鼠,转移早,裸小鼠,T细胞缺陷， NK细胞存在,移植肿瘤于小鼠,转移率正常,先天无NK Bejge 小鼠转移早,（2）巨噬细胞,其活性与转移抑制能力呈正相关,实验表明：,巨噬细胞抑制剂,促进转移,巨噬细胞激活剂,减少转移,（3）T细胞,Ts细胞 促进肿瘤生长与转移,Th细胞 增强杀伤T细胞的作用,杀伤T细胞 抑制和杀伤瘤细胞,问题与展望：,转移各步骤和不同微环境中癌细胞基因表达谱变化尚难确定。,肿瘤临床诊断、疗效评价及预后判断的敏感标记物有待确定。,高通量技术平台的建立将为肿瘤转移研究带来新的希望。,策略,针对肿瘤细胞（,严打：,应用各种细胞毒药物）,针对瘤细胞生存微环境（,整治环境,）,二、抗转移治疗的新策略,抗转移治疗的新方法,即针对肿瘤血管形成的某些因子及其关键步骤进行干预, 抑制血管内皮细胞活化类药物，如RhuMAb VEGF， FLK-1(DC101),(2) 抑制血管内皮细胞的分裂与,迁移,如Angiostatin(血管抑素），endostatin（内皮抑素），,TNP-470,(3)抑制基底膜或细胞外基质降解类药物,(4)封闭整合素功能类药物,2. 细胞粘附分子抑制剂与抗转移,（1）阻止粘附信号的传递,蛋白酪氨酸激酶(PTK),抑制剂（Genistein),（3）增强E-cadherin介导的同质粘附,（2）抑制Integrins 依赖性的粘附 如 环孢霉素等,（1）MMPs抑制剂,a. Batimastat,为人工合成的小分子MMP,抑制剂，能与MMP活性基,团结合，能抑制MMP-2,9等,b. Marimastas,为第二代人工合成MMP抑制剂，副作用小，病人耐受好等，能抑制多种MMP活性,（2）uPA 抑制剂如抗uPA抗体及多肽,1. 定义,基因治疗,将正常的外源基因导入生物体或人体靶细胞内以弥补所缺失的基因、或关闭、降低异常表达的基因，以达到治疗疾病的目的。, 增强宿主抗癌免疫, 恢复或增强抑癌基因的功能, 阻断癌基因, 增强化疗和放疗敏感性, 细胞基因杀伤效应,1.,ex vivo,途径,: 将人体细胞从体内取出, 基因改造, 再移植到人体中. 自体,同种异体, 异种细胞, 同种异体或异种组织和器官等.,2.,in vivo,途径,: 直接将基因转移到人体中, 如DNA注射,口服, 喷雾等. 有如普通治疗药物, 商业化发展方向所在.,基因治疗的,ex vivo,途径,基因治疗就与打针和吃药一样.,基因治疗的,in vivo,途径,举例,nm23 gene,TIMP gene,转染,高转移癌细胞,转移能力降低,三、肿瘤侵袭转移研究的基本策略与技术,（一）研究策略,整体水平：人癌动物模型,自发性癌症动物模型,诱发性癌症动物模型,可移植性癌症动物模型（裸鼠，SCID小鼠）,转基因癌症动物模型,细胞水平（细胞培养、杂交瘤技术等）,裸小鼠特征：,外观无毛，裸体，皮肤薄，发育迟缓。,无胸腺,T细胞功能欠缺,无细胞毒效应，无移植排斥,成年鼠NK细胞活性增加,抵抗力低,11号染色体突变,SCID小鼠特征,(,S,evere,C,ombined,I,mmune,D,eficency,),外观正常,16号染色体突变，T、B缺陷,免疫学特征为T 、B细胞明显减少,细胞水平（细胞培养技术等）,组织水平研究,分子水平研究,染色体水平,DNA水平,RNA水平,蛋白水平,（二）高通量技术在肿瘤研究中的应用,重组DNA技术,PCR,RT-PCR,PCR-SSCP,Southern blot,Northern blot,Western blot,2. 高通量技术的应用,染色体、DNA水平(Genomics),:比较基因组杂交(CGH),RNA水平(Transcriptomics):,差异显示(DD-PCR),抑制消减杂交(SSH)，基因表达系列分析(SAGE),基因芯片(cDNA array).,蛋白质水平(Proteomics):2-D gels,比较基因组杂交(,C,omparative,G,enomic,H,ybridization,CGH,),CGH 原理：,将两种不同荧光标记的基因组DNA等比例与正常分裂中期染色体竞争杂交，分析每条染色体上荧光强度比率，推测待检DNA拷贝数变化。,基本方法：,正常中期染色体制备,基因组DNA分离,DNA标记,杂交和染色,荧光镜检和图象分析,Tissue Microdissection,equipments,Tissue Microdissection,Analysis of single cell by immunohistochemical stain (p53),V.,Sequence analysis to detect mutations,IV.,Stimulated PCR from single cells,III. Microdissection of stained single cells,II.,p53,Immunohistochemical staining,I. Ethanol fixation/paraffin embedding,Breast,Colon,Laser Capture Microdissection (LCM),应用：,确定肿瘤染色体区DNA扩增与丢失,对肿瘤进行分期与分级,诊断与鉴别诊断,预后与治疗反应,RNA水平(Transcriptomics)研究,差异显示(Differential display PCR, DD-PCR),原理：,基因差异表达,用oligo-dT引导逆转录，再用随机引物和逆转录（锚定引物）扩增cDNA片段，PAGE胶分离，比较胶上差异条带识别差异表达基因。,操作步骤,样品RNA分离,反转录成cDAN,PCR扩增,电泳,结果分析,DD-PCR,SSH,抑制削减杂交(SSH),样品1,样品2,基因芯片,原理与操作步骤,在固相支持物上合成/印迹探针阵列,样品（DNA/mRNA）标记,样品与芯片杂交,激光扫描、计算机分析表达谱,蛋白质组技术（Proteomics),表达蛋白质组学和功能蛋白质组学,蛋白质双向电泳（2-D gel),图像采集与计算机分析,质谱技术,蛋白质芯片技术,2-D gels,Protein arrays,Summary:,Tumor samples,Genomics,transcriptomics,proteomics,Delection,Amplification,Methylation,Mutation,(,CGH array,),Protein profiles,(2-D gel,Mass spectrometry,protein microarray,Molecular classification,Biomarkers,Target therapy,Gene profiles,(cDNA microarray,SAGE),Tissue/cells,Tissue arrays,Cell arrays,Nature is beautiful,Research is fascinating,主要参考文献,1. 曾益新主编，,肿瘤学，,人民卫生出 版社：1999，第一版,2. 汤钊猷主编，,现代肿瘤学,，上海医 科大学出版社, 2001，第二版,3. 陈意生等主编,肿瘤分子细胞生物学,人民军医出版社：2002，第一版,3、高进主编，,癌的侵袭与转移基础研究与临床,，北京医科大学中国协和医科大学出版社，1996，第一版,4、鄂 征主编，,癌变机理研究,，北京出版社，1999，第一版,5、近期有关肿瘤研究新文献,Cancer ,Cancer Research,Nature, Science,. 分子生物学分册,. 生理病理科学与临床分册,癌症,中华肿瘤杂志等等。,