胚胎冷冻保存

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,胚 胎 冷 冻 保 存,将胚胎贮存在,196,超低温下长期保存的方法。这是,20,世记,70,年代试验成功的一项新技术，是胚胎移植技术的重大突破。,胚胎冷冻保存的基本概念,胚胎冷冻保存的意义,胚胎移植不受时间和地点的限制，提高了胚胎移植技术的效率；,长期保存优良母牛基因最可靠的技术措施；,便于国际间交流；,替代种畜引种。, 渗透性：,甘油、乙二醇（,EG,）、丙二醇（,PG,）和,DMSO,等，防止溶质效应。, 非渗透性：,蔗糖、海藻糖、聚乙二醇、,PVP,和聚蔗糖等，降低胚胎外液的冰点，减少胚胎外冰晶形成，并能促使胚胎内部的水分外流，从而最终减少胚胎内部冰晶的形成。,基础液：,mPBS,（改良）、,TCM-199,、,PBS,、,HEPES,等，最常用,mPBS,。,抗冻剂的种类及作用,特点：分子量小于,100,，易于渗透,特点：分子量大，不进入细胞,玻璃化的概念：,是一种物理现象，指通过快速降温越过冰晶形成的阶段，不发生结晶即可固化，使溶液形成一种无规则结构的稳定玻璃样固体，且保持液态时正常的分子和离子分布，则胚胎细胞免受损伤。,即高浓度的抗冻剂，急速冷却后，液体的黏性增加，冰晶不能形成，由液态变为透明半固态的现象。,玻璃化溶液（,VS,）：,细胞内液抗冻剂：,这种抗冻剂,分子量小，容易透过细胞膜，,使其内部迅速达到玻璃化所需要的浓度，所以称为细胞内液抗冻剂。如二甲基亚砜、甘油、丙二醇，乙酰胺及乙二醇等。,细胞外液抗冻剂：,这种抗冻剂,分子量较大，一般很难透过细胞膜，,所以称为细胞外液抗冻剂。如聚乙二醇、聚蔗糖、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖及牛血清白蛋白（,BSA,）等。,上述两种抗冻剂组合后，用基础液,mPBS,调制成各种玻璃化溶液。,抗冻剂的种类及作用, 结晶变化：,温度降至冰点时，冰晶首先在胚胎外液形成。温度、冰晶和外液的溶质浓度，迫使胚胎内部的水不断外流，胚胎内部溶质浓度增加。, 溶质效应：,降温速度太慢，胚胎内水充分外流，溶质浓度极度增加，细胞膜的脂蛋白复合物和胞质内的一些其他功能蛋白变性，造成对胚胎的不可逆损害。, 机械效应：,降温速度过快，胚胎内部的水来不及溢出到胚胎外面而直接在胚胎内部形成冰晶，从而对胚胎造成致命的机械损伤。,胚胎冷冻保存过程中的变化和损伤, 常规冷冻法：,“植冰”后控制降温速度，避免过快以免胚胎内部形成大块冰晶；避免过慢，以免胚胎过分脱水而产生溶质效应。, 超速冷冻法：,非渗透性防冻剂对胚胎进行冻前脱水处理，将胚胎平衡一段时间，而后投入液氮保存。, 玻璃化冷冻法：,应用高浓度防冻剂，使胚胎内外液的同源晶核形成温度与玻璃态转化温度基本接近，控制防冻剂与胚胎的平衡时间和温度，使防冻剂对胚胎毒性降低到最低程度。胚胎内外液能迅速转化形成玻璃体，直接投入液氮保存。,胚胎冷冻保存方法,历史：,1972,年首先获小鼠胚胎冷冻成功；,1973,年牛的胚胎冷冻后获得成功，并产下后代。,操作流程：,（,1,）抗冻液中平衡：,室温下（,20,25,），在含有,1,2,摩尔升抗冻剂的磷酸缓冲液（,PBS,）中，胚胎经,10,分钟平衡，使细胞内部抗冻剂浓度基本达到饱和。,常 规 冷 冻 法,（,2,）植冰（诱发结冰）：,植冰的概念：,在液氮中冷却后的镊子或棉签夹住塑料细管上端（棉栓端），使抗冻液迅速通过,6,左右冰点，强制性地使细胞外液形成冰晶，称之为植冰。,目的：,当温度降到抗冻液冰点附近时，经植冰迅速冻结，以防胚胎细胞内部产生冰晶，给胚胎造成物理性的损伤，致使胚胎死亡。,将胚胎移入事先配置好抗冻液的,0.25,毫升塑料细管内封口后进行冷却。当温度降至,6,左右时，用上述方法诱发结冰。,常 规 冷 冻 法,（,3,）自动降温仪中缓慢降温,：植冰后的细管按一定速度缓慢降温。,以,0.33,分钟降至,30,35,时投入液氮；,以,1.0,分钟的速度降至,80,时投入液氮；,以,0.5,分钟降至,30,35,时投入液氮。,原理：,植冰后使细胞外液浓度相对增高，促使细胞内部水分充分脱出，因此缓慢降温是非常必要的。由于脱水使细胞内部充分收缩，同时抗冻剂渗透到细胞内部使内部溶液黏性增大，这时投入液氮中，由于过冷抑制冰晶形成。,常 规 冷 冻 法,（,4,）解冻：,贮存在液氮中的塑料细管取出后，迅速浸入室温或,37,水浴中解冻。,（,5,）除去抗冻剂：,原因：,解冻后的胚胎，细胞内部抗冻剂浓度较高，对胚胎有毒害作用；此外，若直接移入等渗生理溶液中，水分会伸入细胞内引起膨胀，使细胞受损伤。,抗冻液：,蔗糖溶液；,操作：,解冻后胚胎由,浓度高的抗冻液,中移向,浓度低的抗冻液，进行梯度稀释,；即将胚胎先移入高渗蔗糖溶液中，再移入低渗蔗糖溶液中，在脱水的同时脱出抗冻剂，而后移入等渗生理溶液中洗净，待胚胎基本复原后进行移植或继续培养。,常 规 冷 冻 法,从培养液中吸取胚胎，并放置在冷冻液中,: 1.5M,乙二醇,+,蔗糖,+ PBS + AA + FCS,装入细管,(,编号预先准备好,),放入冷冻容器,-6.0,Seeding ice,每分钟降低,0.5,，,一直到,-30,为止,放入液氮容器,常 规 冷 冻 程 序,玻璃化的概念：,是一种物理现象，指通过快速降温越过冰晶形成的阶段，不发生结晶即可固化，使溶液形成一种无规则结构的稳定玻璃样固体，且保持液态时正常的分子和离子分布，则胚胎细胞免受损伤。,即高浓度的抗冻剂，急速冷却后，液体的黏性增加，冰晶不能形成，由液态变为透明半固态的现象。,玻璃化溶液（,VS,）：,细胞内液抗冻剂：,这种抗冻剂,分子量小，容易透过细胞膜，,使其内部迅速达到玻璃化所需要的浓度，所以称为细胞内液抗冻剂。如二甲基亚砜、甘油、丙二醇，乙酰胺及乙二醇等。,细胞外液抗冻剂：,这种抗冻剂,分子量较大，一般很难透过细胞膜，,所以称为细胞外液抗冻剂。如聚乙二醇、聚蔗糖、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖及牛血清白蛋白（,BSA,）等。,上述两种抗冻剂组合后，用基础液,mPBS,调制成各种玻璃化溶液。,胚胎玻璃化冷冻,几种常见的玻璃化冷冻方法：,（,1,）,Rall,等（,1985,）玻璃化冷冻保存法：,是最初发明的玻璃化冷冻保存方法，他们采用的,VS1,玻璃化溶液，是以透过性抗冻剂二甲基亚砜,（,DMSO,）为主体溶液,，为缓和其化学毒性，添加了乙酰胺,(AA),、丙二醇,(PG),和非透过性抗冻剂聚乙二醇,(PEG),。,PEG,具有促进玻璃化形成的作用。胚胎在玻璃化溶液中平衡时，浓度由低到高（,25,50,100,VS1,）；平衡温度由高到低（,22,4,4,）三步完成，计,35,分钟平衡后投入液氮中冷冻保存。,胚胎玻璃化冷冻,（,2,）,Scheffen,等玻璃化冷冻保存法：,主体抗冻剂：,丙三醇（,G,）和丙二醇,(P),；,玻璃化溶液：,上述两种抗冻剂各含,25,混合而成,(PG25),，两者混合后可降低溶液的化学毒性，无需添加细胞非透过性抗冻剂。,方法：,室温下（,20,25,），胚胎于,10,丙三醇溶液中平衡,10,分钟，然后在,PG25,中平衡,30,秒钟，然后投入液氮中冷冻保存。,（,3,）,Kasai,等玻璃化冷冻保存法：,抗冻剂：,乙二醇（,EG,）为细胞内液抗冻剂（透过性保护剂），其具备分子量小、溶液渗透压高、细胞膜透过性强的特点；聚蔗糖（,Ficoll,）为细胞外液抗冻剂，有利于促进玻璃化形成；蔗糖,(Sucrose),是为了冷冻前胚胎细胞的脱水，细胞内部,EG,的调整及解冻后的,EG,的脱出。,玻璃化溶液：,上述三种抗冻剂经,mPBS,调整成,EFS,玻璃化溶液；,方法：,室温胚胎在,EFS,玻璃化溶液中,2,5,分钟平衡后，即投入液氮。,胚胎玻璃化冷冻,（,2,）,Zhu,等玻璃化冷冻保存法：,主体抗冻剂：,乙二醇、甘油和二甲基亚砜；,玻璃化溶液：,EFS,、,GFS,和,EDFS,；,方法：,室温下，将胚胎在,10,乙二醇或,10,甘油或,10,乙二醇,10,二甲基亚砜中平衡,5,分钟，再移入,EFS,或,GFS,或,EDFS,玻璃化溶液中平衡,30,秒钟，即两步法冷冻保存。此方法重复性较高，对实验动物及各种家畜的胚胎皆可进行冷冻保存。,胚胎玻璃化冷冻,胚胎细管编号,E546 - SM 4567891,%,2223333,M 1,98 Mar, 27,胚胎公司冷冻编号,配种编号,供体母牛登记,公牛登记,冷冻日期,直接移植胚胎号,胚胎发育阶段,胚胎质量,Betsy,DT 1,胚 胎 细 管 编 号,胚胎装管,保护细胞膜免受损害；,保护胚胎细胞，免受晶体损害；,具有,“,渗透活性,”,；,解冻后保护剂必须从细胞内去掉；,甘油（丙三醇）：普通的冷冻和解冻剂，通过细胞膜慢慢扩散，为避免渗透休克，必须缓慢去掉；,乙二醇,：直接胚胎移植方法,通过细胞膜快速扩散， 因而不需要慢慢去掉。,冷冻保存的要点,胚 胎 解 冻,解冻方法：,慢速解冻：,以,4-25/min,的速率使胚胎由冷冻保存温度逐渐升至室温，适用于慢速冷冻的胚胎。当温度由,-196 ,升到,-50,-15 ,埋，细胞内仍可能形成大冰晶而致死胚胎。,快速解冻：,温水浴法，以,300-360 /min,的速率使胚胎在,30-40s,内从,-196 ,至室温。,胚 胎 解 冻,脱除保护剂：,目的：,防止保护剂对胚胎的毒性；,防止因细胞内保护剂浓度过高，导致胞内外渗透压差过大，而使胞外水分内流，最终使胚胎过度膨胀受损。,经典方法：,浓度递减的保护液逐步稀释脱除，繁琐费时，但有效；,蔗糖,等非渗透性保护液逐步脱除，使用较多；,