第二章细胞的破碎与分离

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第二章 细胞的破碎与分离,Cell Disruption and Separation,1,本章内容,生物分离过程的一般流程,2,主要内容,概述细胞破碎,细胞壁的结构和化学组成,细胞壁的破碎,方法试剂设备,3,1,概述,不同类型的细胞分泌目标产物的类型：,动物细胞多分泌到细胞外培养液,植物细胞多为胞内产物,微生物（细菌,/,酵母,/,真菌）胞内、胞外,对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行破碎。,4,1,概述,大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖，及氨基酸等目标产物存在于发酵液中。,有些目标产物存在于生物体中。,尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质是在细胞内沉积。,脂类物质和一些抗生素包含在生物体中。,5,1,概述,胞外产品：各种胞外酶、胞外多糖、细胞代谢物如氨基酸、抗生素,细胞本身： 单细胞蛋白 如面包酵母,胞内产品：,各种胞内酶,、基因工程产物,6,1,概述,目标产品位置,7,1.,概述,细胞破碎,指采用一定的方法，在一定程度上破坏细胞壁和细胞膜，设法使胞内产物最大程度的释放到液相中，破碎后的细胞浆液经固液分离除去细胞碎片后，再采用不同的分离手段进一步纯化。,细胞破碎,指选用物理、化学、酶或机械的方法来破坏细胞壁或细胞膜。,8,细胞破碎,本质上是一种增溶作用，细胞破碎的阻力来自于细胞壁的结构和组成的差异。,细胞的结构根据细胞种类而异，动物、植物和微生物细胞的结构差异很大。,动物细胞、嗜盐菌和支原体没有细胞壁，易于破碎；,植物细胞和微生物细胞有坚固的细胞壁，破碎困难，需用强烈的破碎方法。,9,2,细胞壁的结构和化学组成,原核生物,细菌,肽聚糖、多糖、磷壁酸，主要阻力来自于肽聚糖的网状结构；,革兰菌细胞壁结构图,真核生物,酵母菌,葡聚糖、甘露聚糖、蛋白质，主要阻力来自于壁结构交换的紧密程度和厚度；,酵母细胞壁结构示意图,真菌,多糖、蛋白质、脂类、葡聚糖、几丁质，主要阻力来自于壁强度和聚合物网状结构。,10,革兰菌细胞壁结构图,11,酵母细胞壁结构示意图,12,各种微生物细胞壁的结构和组成,微生物的细胞壁都由网状的高分子聚合物构成，破碎的难易程度主要取决于构成细胞壁的聚合物的种类及细胞壁的厚度和强度。,13,植物细胞壁的结构,对于已生长结束的植物细胞壁可分为,初生壁和次生壁。,初生壁是细胞生长期形成的。,初生壁一般较薄,(1,3m),，富有弹性。由多糖和蛋白质构成，多糖主要成分为纤维素、半纤维素和果胶类物质。纤维素是长链,D-,葡聚糖，许多这样的长链形成微纤丝，构成细胞壁的骨架，细胞壁的机械强度主要来自于微纤丝。,某些植物细胞，当生长停止后，在细胞质和初生细胞壁之间形成了次生细胞壁。,次生壁一般较厚,(4,m,以上,),，纤维素和半纤维素含量比初生壁增加很多，纤维素的微纤丝排列得更紧密和有规则，而且存在木质素的沉积。因此次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性，使植物细胞具有很高的机械强度。,14,3,细胞壁的破碎,15,3.1,破碎率的评价（三种）,破碎率,：,被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比数。,Y(%)=(N,0,-N)/N,0,100,N,0,:,原始细胞数量；,N,：,t,时间操作后未损害完整细胞数量；,16,1,）直接测定法,利用显微镜或电子微粒计数器可直接计数完整细胞的量。,染色法,例如，破碎的革兰氏阳性菌可染色成革兰氏阴性菌的颜色，利用革兰染色法使未受损害的酵母细胞呈现紫色，而受损害的酵母细胞呈现亮红色。,17,2),目的产物测定法 蛋白质量或酶的活力,细胞破碎后，测定悬浮液中,细胞内含物,的增量来估算破碎率。,通常将破碎后的细胞悬浮液离心，测定上清液中蛋白质的含量或酶的活力，并与,100%,破碎所获得的标准值直接比较。,18,3),导电率测定法,细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相，使导电率上升。,19,3.2,细胞破碎的方法,分 类,作 用 机 理,适 应 性,机,械,法,珠磨法,固体剪切作用,可达较高破碎率，可较大规模操作，大分子目的产物易失活，浆液分离困难,高压匀浆法,液体剪切作用,可达较高破碎率，可大规模操作，不适合丝状菌和革兰氏阳性菌,超声破碎法,液体剪切作用,对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈，不适合大规模操作,非,机,械,法,酶溶法,酶分解作用,具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，溶酶价格高，通用性差,化学渗透法,改变细胞膜的渗透性,具一定选择性，浆液易分离，但释放率较低，通用性差,渗透压法,渗透压剧烈改变,破碎率较低，常与其他方法结合使用,冻结融化法,反复冻结,-,融化,破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产物,干燥法,改变细胞膜渗透性,条件变化剧烈，易引起大分子物质失活,20,1),机械法,珠磨法,高压匀浆法,超声波法,21,1),1,固体剪切方法,珠磨法,(bead mill,),原理：进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于,1mm,）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。破碎中产生的热量一般采用夹套冷却的方式带走。,适于绝大多数微生物细胞的破碎，更适合于真菌菌丝和藻类。,22,WSK,卧式高效全能珠磨机,ZM,系列卧式密闭珠,(,砂,),磨机,23,珠磨法,(bead mill,),实验室规模的细胞破碎设备有,Mickle,高速组织捣碎机、,Braun,匀浆器；,中试规模的细胞破碎可采用胶质磨处理；,在工业规模中，可采用高速珠磨机,(,瑞士,WAB,公司和德国西门子机械公司制造,),。,珠磨法的破碎率一般控制在,80%,以下：降低能耗、减少大分子目的产物的失活、减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不易分离而给后续操作带来的困难。,24,珠磨法,(bead mill),特点：,适用对象较广,工业化、实验室中应用,细胞完全破碎,需冷却,25,1,）,2,液体剪切方法 高压匀浆法,High-pressure homogenization,大规模细胞破碎的常用方法,采用高压匀浆器（由高压泵和匀浆阀组成，英国,APV,公司和美国,Microfluidics,公司均有产品出售）。,利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破碎，细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。,26,高压匀浆器示意图,27,高压匀浆法,High-pressure homogenization,特点：,适用对象广，最适合于酵母和细菌；,工业化、实验室中应用,细胞完全破碎,易造成堵塞的团状或丝状真菌，,较小的革兰氏阳性菌，,含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）,不宜采用高压匀浆法。,28,1,）,-3 X,挤压器法,X-press,法,改进的高压方法,：将浓缩的菌体悬浮液冷却至,-25,形成冰晶体，利用,500MPa,以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。,细胞破碎是由于冰晶体的磨损，使包埋在冰中的微生物变形而引起的。,此法主要用于实验室，适应范围广、破碎率高、细胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等优点，但不适应于对冷冻敏感的生化物质。,29,1)-4,超声波法,Ultrasonication,利用超声波振荡器发射的,15-25kHz,的超声波探头处理细胞悬浮液。,超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。,超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的声频、声能有关。,30,电声超声波发生器 示意图,31,JY92-II D,超声波,细胞粉碎机,32,超声波法,Ultrasonication,其原理可能与空化现象,(,cavitation,phenomena),引起的冲击波和剪切作用有关。,空穴泡由于受到超声波的迅速冲击而闭合，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞液体发生流动，从而使细胞破碎。,操作过程产生大量的热，因此操作需在冰水或外部冷却的容器中进行。,33,超声波破碎的适用范围,超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物的破碎。,一般杆菌比球菌易破碎，,G-,细菌比,G+,细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。,但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活；,超声波破碎的有效能量利用率极低；,由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，但在实验室小规模细胞破碎中常用。,34,不同机械破碎方法的比较,技术,原理,效果,成本,举例,匀浆法,(,孔型,),须使细胞通过的小孔，使细胞受到剪切力而破碎,剧烈,适中,细胞悬浮液大规模处理,珠磨破碎法,细胞被玻璃珠或铁珠捣碎,剧烈,便宜,细胞悬浮液和植物细胞的大规模处理,超声波法,用超声波的空穴作用使细胞破碎,适中,昂贵,细胞悬浮液小规模处理,35,机械破碎法,需要高能量，且产生高温和高剪切力，易使不稳定产品变性失活；,破碎的有机体或释放的产物，不专一，并且产生碎片的尺寸范围大，后处理难度大；,36,2,）非机械法,I,酶法溶胞,Enzymatic,Lysis,，酶解法，酶溶法,利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的键，从而达到破碎的目的。,外加酶法,自溶法,37,3. 3,非机械法,外加酶法,利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构和化学组成选择适当的酶，并确定相应的次序。,38,I,外加酶法,常用的溶酶,溶菌酶、,-1,，,3-,葡聚糖酶、,-1,，,6-,葡聚糖酶、,蛋白酶、,甘露糖酶、,糖苷酶、,肽键内切酶、,壳多糖酶等,溶菌酶主要用于细菌类,细胞壁溶解酶是几种酶的复合物,39,重要微生物细胞壁的降解酶,40,外加酶法,溶菌酶能专一性地分解细胞壁上肽聚糖分子的,-1,4,糖苷键，因此主要用于细菌类细胞壁的裂解。革兰氏阳性菌悬浮液中加入溶菌酶，很快就产生溶壁现象。但对于革兰氏阴性菌，单独采用溶菌酶无效果，必须与螯合剂,EDTA,一起使用。,放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖为主要成分，所以也能采用溶菌酶,;,酵母和真菌由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、几丁质等，常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等,;,植物细胞壁的主要成分是纤维素，常采用纤维素酶和半纤维素酶裂解。,41,外加酶法,有时采用几种酶的混合物会产生更好的效果，加入时需确定相应的次序。,对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质,-,甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破裂，释出胞内产物。,42,外加酶法,优点：,产品释放的选择性高；抽提的速率和收率高；产品的破坏最少；对,pH,值和温度等外界条件要求低；不残留细胞碎片。,费用,高，通用性差。,适用性,：,小规模的实验室研究。,43,酶法溶胞 自溶法,Autolysis,自溶作用,是酶解的另一种方法，所需溶胞的酶是由微生物本身产生的。微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水解细胞壁上聚合结构的酶，以便使生长过程进行下去。,改变微生物的环境，可诱发产生过剩的这种酶或激发产生其他的自溶酶，以达到自溶目的。,影响因素,温度 时间,pH,缓冲液浓度、细胞代谢途径等,缺点,：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。,44,II,化学渗透法,Chemical permeation,化学法,用某些化学试剂溶解细胞壁或抽提细胞中某些组分的方法,化学渗透法,某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。,该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。,45,II,化学渗透法,(1),酸碱法,调节,pH,值,酸处理可以使蛋白质水解成氨基酸，通常采用,6mol/L,HCl,。,碱能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从细胞内渗漏出来。,成本低，反应激烈，不具选择性。,46,II,化学渗透法,(2),有机溶剂法,能分解细胞壁中的类脂，使胞壁膜溶胀，细胞破裂，胞内物质被释放出来。丁醇、丙酮、氯仿、甲苯,(3),表面活性剂法,无论表面活性剂是阴离子、阳离子还是非离子型，都是两性的，既能和水作用也能和脂作用，能与细胞壁上的脂蛋白结合，形成微泡，使膜的通透性增加或溶解,细胞破碎常用的表面活性剂：,胆酸盐、磷脂等,十二烷基硫酸钠（,SDS,，阴离子型）；非离子型如,Triton X-100,和吐温（,Tween,）等,;,对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。,47,II,化学渗透法,(4)EDTA,螯合剂,处理,G-,细菌，对细胞壁外层有破坏作用。,G-,细菌的壁外层结构通常靠二价阳离子,Ca,2+,或,Mg,2+,结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦,EDTA,将,Ca,2+,或,Mg,2+,螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。,48,II,化学渗透法,Chemical permeation,优点：,对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内；,细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。,缺点：,通用性差；时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过,50%,；有些化学试剂有毒；,化学试剂的加入常会给随后产物的纯化带来困难， 并影响最终产物纯度,。,49,III,物理法,渗透压冲击法,冻融法,干燥法,50,渗透压冲击法,Osmotic pressure,渗透压冲击是较温和的一种破碎方法,将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），达平衡后，转入到渗透压低的缓冲液或纯水中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞溶胀，甚至破裂。,仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。,51,冻融法,将细胞放在低温下突然冷冻,(,约,-15),，而在室温下缓慢融化，反复多次而达到破壁作用。,由于冷冻，一方面使细胞膜的疏水键结构破裂，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞膨胀而破裂。,适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。,52,干燥法,将细胞用不同的方法干燥，细胞膜渗透性发生变化而破裂，然后用丙酮、丁醇或缓冲液等溶剂抽提胞内物质。,干燥方法：,空气干燥、真空干燥、喷雾干燥、冷冻干燥等,气流干燥主要适用于酵母菌，一般在,25-30,的气流中吹干；真空干燥多用于细菌；冷冻干燥适用于不稳定的生化物质。,53,细胞破碎方法的比较,分 类,作 用 机 理,适 应 性,机,械,法,珠磨法,固体剪切作用,可达较高破碎率，可较大规模操作，大分子目的产物易失活，浆液分离困难,高压匀浆法,液体剪切作用,可达较高破碎率，可大规模操作，不适合丝状菌和革兰氏阳性菌,超声破碎法,液体剪切作用,对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈，不适合大规模操作,X-press,法,固体剪切作用,破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目的产物不适合,非,机,械,法,酶溶法,酶分解作用,具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，溶酶价格高，通用性差,化学渗透法,改变细胞膜的渗透性,具一定选择性，浆液易分离，但释放率较低，通用性差,渗透压法,渗透压剧烈改变,破碎率较低，常与其他方法结合使用,冻结融化法,反复冻结,-,融化,破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产物,干燥法,改变细胞膜渗透性,条件变化剧烈，易引起大分子物质失活,54,破碎方法选择准则,1),细胞的处理量,2),细胞壁的强度和结构,3),目标产物对破碎条件的敏感性,4),破碎程度,55,破碎技术的未来发展方向,多种破碎方法相结合；,与下游过程相结合；,与上游过程相结合；,化学法、酶法、机械法相结合。,如用溶解酶预处理面包酵母，然后高压匀浆，,95MPa,压力下匀浆,4,次，总破碎率接近,100%,。而单独采用高压匀浆法，同样条件下破碎率只有,32%,。,在发酵培养过程中，培养基、生长期、操作参数,(,如,pH,、,温度、通气量、搅拌转速、稀释率等,),等因素都对细胞壁膜的结构与组成有一定的影响。细胞的破碎与上游培养过程有关。,用基因工程的方法对菌种进行改造，以提高胞内物质的提取率也是非常重要的。,在生长后期，加入某些能抑制或阻止细胞壁物质合成的抑制剂,(,如青霉素、环丝氨酸等,),，继续培养一段时间后，新分裂的细胞其细胞壁有缺陷，利于破碎；,选择较易破碎的菌种作为寄主细胞，如革兰氏阴性细菌；,在细胞内引进噬菌体基因，培养结束后，控制一定条件,(,如温度等,),，激活噬菌体基因，使细胞自内向外溶解，释放出内含物。,细胞破碎与固液分离紧密相关,。,56,3.4,基因工程包含体的纯化方法,包含体：,一种蛋白质的聚集体，其中大部分是克隆表达的目标产物蛋白，其次还有大肠杆菌的菌体蛋白和质粒编码蛋白等。,步骤：,收集菌体细胞细胞破碎包含体的洗涤目标蛋白的变性溶解目标蛋白的复性,57,作业,1,、细胞破碎主要有哪几种方法？,2,、机械法细胞破碎方法与非机械破碎方法相比有何特点？,3,、珠磨法破碎大肠杆菌细胞，破碎速率常数,k = 0.048 min,-1,。若采用间歇破碎操作，试计算破碎率达到,90%,所需的时间。,58,