神经系统遗传病的基因诊断

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,神经系统遗传病的基因诊断,杜万良,北京天坛医院神经内科,基因,DNA,上的功能单位。,基因结构模式图：,基因突变,DNA,分子结构的化学变化。,突变的类型,碱基替换,：某个碱基被另一个碱基所取代（,点突变,）。嘌呤或嘧啶之间的取代为,转换,；嘌呤与嘧啶之间的取代为,颠换,。,同义突变：突变后密码子改变但氨基酸不变化。,错义突变：突变后氨基酸发生改变。,无义突变：突变后变为终止密码。,碱基插入和缺失：由于碱基的增多或减少造成阅读框架的改变,移码突变,。,以上突变为,稳定突变,，即传递中不再变化的突变。,动态突变,：传递中不断发生变化的突变，如三联体核苷酸数目的变化，一般是由于不等交换所致。,突变的一般特性,可逆性,(A,a, aA),多向性,(A,a1, a2, a3, a4),有害性,稀有性,(Human, 10,-6,),可重复性,(Hot site),遗传病,由于遗传物质缺陷或发生改变而导致的机体结构和功能的紊乱。,遗传病的危害,1,、发病率逐年上升,2,、住院儿童近,1/3,为遗传相关疾病,3,、自然流产胚胎,60%,有染色体畸变,4,、平均每人携带,56,个有害基因,5,、人群中,25%,患有各类不同程度的遗传相关疾病,6,、绝大多数遗传病目前没有理想的治疗方法,遗传病的分类,染色体病,单基因病,多基因病,线粒体基因病,染色体病,染色体病,:,染色体数目或结构异常。,常染色体病的共同特征：,智力低下、发育迟缓、多发畸形。,性染色体病的共同特征：,性征发育不全或畸形、智力较低。,21-,三体综合征,21-,三体又称先天愚型，,Down,综合征。,1866,年英国医生,JLH Down,首先描述，,1959,年法国,Lejeune,证实该病的病因是由于,G,组染色体多了一条，后确定为,21,号。,发病率：,1/6001/800,。,临床表现：,、特殊面容,眼距宽、鼻塌平、口半开、流口水、耳廓小、手足短。,、发育不良、肌张力低、关节松弛、新生儿有第三囟门。,、部分患者有特殊肤纹，如通贯手、,atd,角达,64,(,正常人,41),，,、半数患者伴有先天性心脏病，白血病发病率高于正常,20,倍。男性基本无生育能力，女性少数可有生育能力。大部分寿命不长，少数可达,50,岁以上。,单基因病,单基因病：染色体上单一基因的一个或两个等位基因突变。,严格按照孟德尔规律遗传,临床上最多见。,多基因病,多基因病：一个或多个基因与一种或多种环境因素共同作用产生的疾病。,没有严格的孟德尔传递规律。,病种少，但患病者多。,线粒体遗传病,线粒体遗传病是由于,mtDNA,的突变所导致。,有性生殖的方式决定了线粒体遗传属于母系遗传。（细胞质遗传）,1987,年首次提出线粒体病概念，目前已经发现,100,多种疾病与线粒体,DNA,突变有关,线粒体遗传病,线粒体基因组编码,：,2,个,rRNA,基因和,22,个,tRNA,基因,13,种多肽基因：,核糖体蛋白基因,rps,4,，,rps,13,，,rps,14,细胞色素,C,氧化酶复合体基因,cox,I,，,cox,II,，,cox,III,ATP,酶复合体基因,atp,A1,，,atp,A2,，,atp,A6,，,atp,A9,，,atp,A10,NADH,脱氢酶复合体,I,基因：,ND-1,，,DN-5,遗传病,大多数遗传病为先天性疾病，但先天性疾病不一定是遗传病。,大多数遗传病表现出家族聚集性，但家族性疾病不一定是遗传病。,遗传病诊断,1,、病史、症状、体征 病史采集、外貌特征、发育状况。,2,、系谱分析 单基因，多基因；显性，隐性；常染色体，性染色体。 表现度、外显率、隔代遗传。 遗传方式、发病风险。,3,、染色体检查标本,外周血、绒毛、羊水、活检组织。分带,G-, R-, C-, ,荧光原为杂交,(FISH),分析,数目（单体、多体）、结构（易位、缺失、倒位,),指征,智力障碍、发育畸形、多发流产、不育等。,4,、生化检查 主要用于分子病和先天性代谢缺陷。,5,、基因诊断 直接诊断被检者的,DNA,或,RNA,。发展最快，前景最好。直接,DNA,检测,缺失、突变、重排,.,。间接遗传标记检测,多态性，连锁分析。 基因诊断技术：分子杂交、分子扩增、分子测序。,传统的诊断（举例）：,、问、望、听、触,经验型诊断,、化验,/,检验,材料：细胞、组织、大分子、小分子、代谢,/,排泄物等。方法：细胞学、微生物学、生物化学、免疫学、病理学等。,、影像学,X,光、,B,超、,CT,、核磁共振、内窥镜等。,、特殊检查,染色体检查、肌电,/,心电,/,脑电、骨密度等。,在医学发展的过程中，这些方法发挥了巨大作用，随着技术水平的发展，这些方法也在不断提高和完善，也还会有其他新的诊断方法的问世。,这些诊断有一个无法逾越的鸿沟：,预测,也就是说,“,发病,”,了才能诊断。,基因诊断,Gene Diagnosis,：,detection of genetic disorders by DNA analysis,直接在,DNA,或,RNA,水平上进行结构与功能检测，从而辅助临床进行的诊断。,基因诊断是近年来临床医学中发展十分迅速的一类崭新的诊断技术，它依托,DNA,重组技术，直接从基因型入手，诊断表现型即可以越过产物（酶和蛋白质）直接检测基因结构而作出诊断。（逆向诊断）,基因诊断始于,1978,年，,Kan,第一次成功进行了镰状细胞贫血病的产前基因诊断。,基因诊断具有灵敏度高、特异性强、费用低，并对许多疾病特别是遗传性疾病具有预测性的特点，是一种极具潜力的诊断方法。,基因诊断的对象,1,、病原生物的侵入，如流感、肝炎、艾滋病,2,、单基因遗传性疾病， 如苯丙酮尿症、无丙种球蛋白血症,3,、多基因疾病，如肿瘤、高血压,4,、其它，如亲子鉴定、个体识别、法医物证,神经系统遗传病,Wilsons disease (WD),Huntingtons disease (HD),Cadasil,Melas,(DMD),CMT,SCA,Leigh,基因变异的类型,1,、点突变,）单个碱基置换,）单个碱基的缺失或插入,2,、片段缺失,编码片段；调节序列,3,、片段插入,编码片段；调节序列,4,、重排,融合基因,5,、扩增,拷贝大量增加,6,、动态突变,遗传物质传递过程中不等交换使,STR,重复数增加,原理：找突变,基础：,PCR,（聚合酶链反应）,DNA,以指数形式扩增(2,n,),，,其中长片段以线性形式扩增 (2,n+2),，,最终主产物片段长度在两个引物之间。,预变性,(92-95,C,2-5m),变性,(92-95,C,30s),复性,(40-60,C,30s),延伸,(72,C,30-60s),总延伸,(72,C,7m),(25-35),PCR,的一般过程：,经过,30,次的循环,扩增的,DNA,片段可达,100,万倍以上。,240,16,256,114,52,22,8,2,0,0,短片段（单链）,14,12,10,8,6,4,2,长片段（单链）,128,64,32,16,总片段（单链）,循环数,策略,1,直接诊断：直接检查致病基因本身的异常。它通常使用基因本身或紧邻的,DNA,序列作为探针，或通过,PCR,扩增产物，以探查基因无突变、缺失等异常及其性质，这称为直接基因诊断，它适用已知基因异常的疾病；,间接诊断：当致病基因虽然已知但其异常尚属未知时，或致病基因本身尚属未知时，也可以通过对受检者及其家系进行连锁分析，以推断前者是否获得了带有致病基因的染色体。连锁分析是基于紧密连锁的基因或遗传标记通常一起传给子代，因而考察相邻,DNA,是否传递给了子代，可以间接地判断致病基因是否传递给子代。连锁分析多使用基因组中广泛存在的各种,DNA,多态性位，特别是基因突变部位或紧邻的多态性位点作为标记。,RFLP,、,VNTR,、,SSCP,、,AMP,FLP,等技术均可用于连锁分析。,遗传标记,1,、第一代遗传标记,限制性酶切片段长度多态性,(,Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP),8kb,5kb,3kb,在个体和群体中，片段长度表现出多态性。,如,3kb, 5kb, 7kb, 8kb,RFLP,呈现孟德尔式遗传。,常用检查方法：核酸杂交；,PCR-,酶切等。,产生多态性的原因是内切酶位点的变化。,原位点的消失；新位点的产生。,GAATTCCTTAAG,GA,T,TTCCT,A,AAG,1 2,1 2,I,II,2kb,3kb,5kb,7kb,2,、第二代遗传标记,微卫星,DNA(Micro-satellite DNA),属高度重复序列，重复单元,26bp,，重复区大多几十,几百,bp,，分散在基因组中，大多不存在于编码序列内，具有较高的多态性。,呈现孟德尔式遗传。,目前微卫星,DNA,已经发现了万余个位点。,TTCAGCTAGCT,CAGCAGCAGCAGCAGCAG,AGCTTGC,AAGTCGATCGA,GTCGTCGTCGTCGTCGTC,TCGAACG,常用检查方法：,PCR,等。,微卫星,DNA PCR,扩增结果（示例）：,500bp,400bp,300bp,240bp,该结果显示在所检查的人群中，该位点多态性有,4,种。,微卫星,DNA,差异最小只相差,2,个碱基（重复片段只有,2,个碱基）。,2,、第三代遗传标记,单核苷酸多态性,(SNP),某些,DNA,位点上，单个碱基存在着变化。如：,AATGGC,G,TAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCC,A,GCT,AATGGC,C,TAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCC,T,GCT,AATGGC,A,TAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCC,G,GCT,个体,A,个体,B,个体,C,SNP,分布于整个基因组，可在基因内，也可在基因间。估计每,1000,个,bp,存在一个。,在人类,DNA,序列变异中，,SNP,占,90%,。,单个碱基的插入和缺失不认为是,SNP,。目前已知基因组中含有,150,万个,SNP,芯片杂交结果示意图,A C G T,位点,1,位点,2,位点,3,常用检查方法：,DNA,测序、芯片杂交等。,常用技术,等位基因特异性寡核苷酸杂交（,allele-specific oligonucleotide,，,ASO,）,当基因的突变部位和性质已完全明了时，可以合成等位基因特异的寡核苷酸探针（,allele-specific oligonucleotide,，,ASO,）用同位素或非同位素标记进行诊断。探针通常为长,20bp,左右的核苷酸。用于探测点突变时需要合成两种或两种以上的探针，一种与正常基因序列完全一致，能与之稳定地杂交，但不能与突变基因序列杂交；另一种与突变基因序列一致，能与突变基因序列稳定杂交，但不能与正常基因序列稳定杂交，这样，就可以把只有一个碱基发生了突变的基因区别开来,.,PCR,可结合,ASO,，即,PCR,ASO,技术，即先将含有突变点的基因有关片段进行体外扩增，然后再与,ASO,探针作点杂交，这样大大简化了方法，节约了时间，而且只要极少量的基因组,DNA,就可进行。,异常探针,T A G,正常人 患者,DNA DNA,点杂交,正常探针,G A G,正常人 患者,DNA DNA,点杂交,单链构象多态性,PCR (SSCP-PCR),DNA,分子在电泳中的行为取决于分子量,和分子构象。,DNA,单链的构象取决于序列。,PCR,产物变形后于中性胶中电泳，与正常,对照比较，若电泳行为异常，则认为内含,突变的碱基。,对照 实验,等位基因特异性,PCR(Allele-Specific PCR, AS-PCR),利用末端突变的引物进行,PCR,。,实际应用中，常使用三个引物：,A3,5,G3,5,5,3,正常上游引物,正常下游引物,突变上游引物,使用正常引物，在正常人有扩增，异常人无扩增。,使用突变引物，在异常人有扩增，正常人无扩增。,（严格条件下的,PCR,）,A,C,G,T,A,T,G,G,T,A,C,C,G,C,A,T,染色体,FISH,探针,整条染色体涂染探针,染色体重复序列探针,染色体专一位点探针,基本过程：,1,、染色体标本制备,2,、探针制备,3,、杂交,4,、显微观察（染色体分带）,整条染色体涂染,通过整条染色体涂染判断易位染色体,引物原位标记技术,(Primed in situ Labeling, PRINS),针对染色体的特异性,-,卫星,DNA,序列设计和合成引物,。,利用未标记的寡核苷酸引物与变性后的染色体,DNA,特异结合,然后用荧光素标记的脱氧核苷酸,(dUTP),与未标记的脱氧核苷酸一起在,DNA,聚合酶的作用下进行延伸反应,标记了的,dUTP,将以碱基配对的形式掺入到新合成的,DNA,单链中,最后用相应的荧光抗体与标记物结合以显示检测结果。,举例,1,DMD,BMD,的缺失型诊断：,DMD,BMD,是一种,连锁隐性遗传的神经肌肉系统受累的致死性遗传病。,DMD,BMD,有,70,左右为缺失型。,此基因很大，缺失可发生在不同部位，因此应尽可能采用多对引物作,PCR,扩增（多重,PCR,）来检测。如扩增产物电泳后发现有带纹的缺失，即可作出诊断并对缺失定位。,在进行产前诊断时，一般可先通过检测家系中有关成员，即确定先证者的缺失区，然后有针对性地作,PCR,扩增，包括缺失部分的两端，以判断胎儿或有关患儿是否也获得了相同的基因缺失，但非缺失型不能用此法查出。,举例,2,脊肌萎缩症（,SMA,）,5q,13.1,SMN1,SMN2,举例,3,Huntingtons Disease (HD),IT15,（,CAG,）,n,举例,4,腓骨肌萎缩症（,CMT,）,Hereditary motor and sensory neuropathies,a clinically and genetically heterogeneous group of inherited neuropathies,demyelination (CMT1),axonal loss (CMT2),autosomal-dominant, autosomal-recessive, and X-linked inheritance,.,myelin protein zero (,MPZ,),early growth response gene 2 (,EGR2,),peripheral myelin protein 22 (PMP22),myotubularin related protein 2 gene (MTMR2),the N-myc downstreamregulated gene 1 (NDRG1),the L-periaxin gene (PRX),the ganglioside-induced differentiation-associated protein 1 gene (GDAP1),connexin 32 gene (,GJB1,),GJB1,alteration (323TC),GJB1,mutation 323TC,举例,5,CADASIL,：,subcortical ischemic stroke and vascular dementia in human adults.,Notch3,is a large gene composed of 33 exons encoding for a 2321 amino-acids protein.,mutations are highly stereotyped missense mutations,located within the 23 exons encoding for the 34 Epidermal Growth Factor (EGF)-like repeats of the extracellular domain of the Notch3 receptor, all mutations resulting either in a gain or a loss of a cysteine residue.,High G-C Content,up to 88% (mean G-C content 66%).,In 65% of the patients, these mutations are clustered within exons 3 and 4 but in the 35% remaining ones, mutations are scattered through the 21 other exons.,举例,6,MERRF,综合症,肌阵挛性癫痫和破碎红纤维病,多系统紊乱，肌阵挛性癫痫，共济失调，轻度痴呆，耳聋，脊髓退化。,大量团块状线粒体聚集于肌细胞中（可被特异性染料染成红色，,破碎红纤维）。大脑卵圆核与齿状核有神经元的缺失。,当线粒体中,90%,存在这种突变，将出现典型症状，当突变比例下降时，症状也随之变轻。,MTTK*MERRF8344G,线粒体突变,转运,RNA,基因,赖氨酸,疾病缩写,突变位置,该位原碱基,问题,各种遗传病的基因异常是不同的，同一遗传病也可以有不同的基因异常 。,根据对基因异常类型的了解，可以采用不同的诊断方法,如基因缺失可用基因探针杂交，,PCR,扩增直接检测；点突变可用等位基因特异的,ASO,探针、,SSCP,等直接检查。一般无需对家系成员进行分析。但条件是必需知道基因异常的性质，并肯定该异常与疾病之间的关系。,然而，由于许多疾病的遗传异质性，以及多数遗传的基因异常尚属未知，目前能直接诊断的病种虽日益增多，但仍然是比较有限的。,策略,2,热点突变,全基因扫描,肝豆状核变性,1. AR,2.,临床症状： 进行性肝硬化，伴有基底神经节豆状核变性，引起神经症状。,3.,病因：,存在细胞膜上的与铜转运有关的,ATP7B,缺陷导致铜不能从细胞内及时清除而在组织中沉积。,4,、基因定位：,13q14.3,ATP7B gene maps to chromosome 13q14.3, contains 21 exons, and encodes a copper-transporting P-type ATPase.,ATP7B mutations are scattered over the entire gene,Wilsons Disease (WD),Rapid identification of Wilsons disease carriers by denaturing high-performance liquid chromatography,Prev Med 2002 Sep;35(3):278-84,Wilsons Disease (WD),Wilsons Disease (WD),Wilsons Disease (WD),the carrier status,additional sequence changes (K952R and T991T),The K952R change obviously does not contribute to the WND phenotype,Analysis of the offspring identified WND patients (III-1, III-3) as compound heterozygotes for N505X and V1146M,no falsepositive results and a single false-negative result (IVS18+6ct),the short PCR product of the 5 UTR (117 bp) eluted well,注意事项,一定要结合临床，突变疾病。,详细询问家族史，画出家系图。,遗传病治疗,遗传病的治疗至今没有理想的方法。以预防为主。,手术治疗,移植、修补、矫正。,药物及饮食,禁其所忌：如苯丙酮尿症者低苯丙氨酸饮食,去其所余：排泄剂、螯合剂、血液过滤等,补其所需：补充酶或其他蛋白,遗传病治疗,基因治疗的发展为遗传病治疗带来了新的希望。,基因治疗是一种用正常或野生型基因导入靶细胞，校正或置换致病基因的治疗方法。,参考书,梁秀龄,.,神经系统遗传性疾病,.,人民军医出版社，,2001.,曾溢滔,.,遗传病的基因诊断与基因治疗,.,上海科学技术出版社，,1999.,谢 谢！,